稻瘟病菌兩個(gè)新基因的功能研究.pdf

1、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)既是經(jīng)濟(jì)重要的病原真菌，也是研究植物與微生物相互作用的重要生物，從全基因組水平分析研究該菌關(guān)鍵基因的功能，可以加速對(duì)稻瘟病菌生物學(xué)及其致病分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為培育持久抗病品種和制定稻瘟病菌持續(xù)管理的策略提供理論依據(jù)。本研究在本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建的T-DNA插入突變體庫(kù)的基礎(chǔ)上，篩選性狀穩(wěn)定的致病相關(guān)突變體，深入分析突變體的表型，克隆和解析相關(guān)基因的生物學(xué)功能。 通過(guò)對(duì)稻瘟病菌FJ95054B

2、的T-DNA突變體庫(kù)的分析，得到一個(gè)表型為產(chǎn)孢缺陷的突變體T16B-2。除了產(chǎn)孢缺陷外，該突變體的附著胞形成率下降，但在洋蔥表皮上的侵入與對(duì)水稻的致病性沒(méi)有變化。Southern雜交結(jié)果表明，該突變是由T-DNA單拷貝插入引起的。將該突變體與GUY11有性雜交所建立的后代群體中，突變體表型與野生型表型比例為1：1，表明此突變體表型由單位點(diǎn)插入造成。TAIL-PCR獲得該突變體的T-DNA側(cè)翼序列，在稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST分析表

3、明，T-DNA側(cè)翼序列位于Super contig 195中，暫將該區(qū)域所調(diào)控的基因命名為ConLW。對(duì)該突變體菌株進(jìn)行功能互補(bǔ)分析，其互補(bǔ)菌株的產(chǎn)孢量和附著胞形成率能夠回復(fù)到野生型水平。 為進(jìn)一步明確ConLW是否為產(chǎn)孢相關(guān)基因，通過(guò)同源重組的方法將該基因敲除，所得到的敲除突變體表現(xiàn)為不產(chǎn)孢且喪失致病性?；蚯贸蛔凅w用野生型基因互補(bǔ)轉(zhuǎn)化后，其互補(bǔ)菌株恢復(fù)了產(chǎn)孢量與致病性。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在ConLW中含有一個(gè)Zn(Ⅱ)

4、2Cys6鋅指蛋白功能域。將該鋅指蛋白功能域與基因自帶啟動(dòng)子區(qū)共同轉(zhuǎn)入基因敲除突變體中，其轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)為產(chǎn)孢缺陷而致病性恢復(fù)的性狀。因此，推測(cè)稻瘟病菌基因ConLW是一個(gè)與產(chǎn)孢和致病性都相關(guān)的基因，其中的Zn(Ⅱ)2Cys6鋅指蛋白功能域與稻瘟病菌致病功能有關(guān)，而與產(chǎn)孢功能無(wú)直接關(guān)系。 在T-DNA插入突變體庫(kù)中篩選獲得三個(gè)對(duì)含抗瘟基因Pi9的水稻品種表現(xiàn)毒性的突變菌株，本研究對(duì)其中一個(gè)突變體Pi9-1-1 T94A進(jìn)行研究。通過(guò)

5、TAIL-PCR的方法獲得該突變體的T-DNA側(cè)翼序列，BLAST結(jié)果表明，T-DNA側(cè)翼序列位于Super contig 5.200中，該序列與一預(yù)測(cè)基因的5’末端有部分同源，將該預(yù)測(cè)基因命名為PthLW。將PthLW進(jìn)行敲除，所獲得敲除突變體對(duì)含抗瘟基因Pi9的水稻品種表現(xiàn)無(wú)毒性，而對(duì)含抗瘟基因Pib的單基因水稻品種(IRBL14)表現(xiàn)毒性。功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該基因不僅能夠使敲除突變體恢復(fù)對(duì)含Pib抗瘟基因水稻品種的無(wú)毒性，也能

6、使Pib品種的田間毒性菌株轉(zhuǎn)化為無(wú)毒性，而不影響這些菌株對(duì)其他水稻品種的致病性。因此，可以確定PthLW為Avr-pib的候選基因。另外，該基因敲除突變體在以不飽和脂肪酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，初步確定該基因具有ATP-NADK激酶活性。本文通過(guò)分析兩個(gè)突變性狀穩(wěn)定的T-DNA插入突變體，進(jìn)一步利用基因敲除與功能性互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，明確了兩個(gè)未知基因ConLW和PthLW的基本功能，為深入研究?jī)苫虻纳飳W(xué)功能和揭示稻瘟病菌的致病分子機(jī)理