南方水稻黑條矮縮病毒與水稻齒葉矮縮病毒協(xié)生作用研究.pdf

1、南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarfvirus,SRBSDV）和水稻鋸齒葉矮縮病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV）同屬于呼腸孤病毒科，前者屬于斐濟(jì)病毒屬，由白背飛虱以持久性增殖型方式傳播，后者屬于水稻病毒屬，由褐飛虱以持久性增殖型方式傳播。SRBSDV是2001年于廣東省陽(yáng)西縣首次發(fā)現(xiàn)、2008年鑒定的水稻病毒新種，近年來(lái)迅速擴(kuò)散至越南北部及我國(guó)南部廣大稻

2、區(qū)，成為生產(chǎn)上最主要的病害之一。RRSV在中國(guó)自1978年首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，一直零星發(fā)生，僅個(gè)別年份和田塊發(fā)生較重。然而近年來(lái)伴隨SRBSDV的大面積爆發(fā)，RRSV在中國(guó)南部呈加重為害的趨勢(shì)，田間出現(xiàn)大量的SRBSDV和RRSV復(fù)合侵染病株。復(fù)合侵染的病毒可能發(fā)生協(xié)生作用，通過(guò)增加寄主體內(nèi)病毒含量，加重病株癥狀表現(xiàn)，提高介體傳毒效率，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成更為嚴(yán)重危害。為了揭示SRBSDV和RRSV復(fù)合侵染時(shí)兩種病毒的互作，本文展開(kāi)了一系列研究，主

3、要結(jié)果如下：
　　1.復(fù)合侵染的水稻植株內(nèi)SRBSDV和RRSV發(fā)生了協(xié)生作用，病害癥狀加劇，病毒含量提高。癥狀觀察表明，復(fù)合侵染導(dǎo)致水稻植株顯癥時(shí)間提前，接毒后第15 d，50％復(fù)合侵染植株上部新生葉片就出現(xiàn)葉尖扭曲癥狀，而SRBSDV和RRSV單獨(dú)侵染的植株在20d時(shí)才觀察到該癥狀。在接種后9d、15d和20d時(shí)，復(fù)合侵染植株的高度分別僅為健康植株的87.8%、50.8%和32.8%，是SRBSDV單獨(dú)侵染時(shí)的90.6%、83

4、.3%和75.5%，是RRSV單獨(dú)侵染時(shí)的92.4%、67.7%和58.4%，復(fù)合侵染造成的植株矮縮顯著重于單獨(dú)侵染。RT-qPCR對(duì)病株中兩病毒所有基因表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果表明，與單獨(dú)侵染相比，早（9d）、中（15d）和后（20d）期3個(gè)病程點(diǎn)復(fù)合侵染植株體內(nèi)SRBSDV P5-1、P7-1、P9-1和P10以及RRSV P3、P6、P8和P10表達(dá)水量均顯著增加。在這些上調(diào)表達(dá)的病毒基因中，除殼蛋白基因外，均為病毒復(fù)制工廠（病毒基質(zhì)）

5、組份相關(guān)基因，暗示復(fù)合侵染時(shí)兩種病毒的復(fù)制能力受到了相互促進(jìn)。
　　2.白背飛虱和褐飛虱從復(fù)合侵染植株上獲毒效率顯著提高。與單獨(dú)侵染植株相比，在病程第9d、15d和20d的植株上飼毒24 h，白背飛虱和褐飛虱從復(fù)合侵染植株上的獲毒效率分別提高了7.4%、27.8%、21.2%和11.5%、19.3%、15.3%。表明SRBSDV和RRSV的協(xié)生同時(shí)增加了兩種病毒介體的獲毒效率，因此，SRBSDV的暴發(fā)不但直接對(duì)水稻生產(chǎn)構(gòu)成威脅，而

6、且通過(guò)與RRSV協(xié)生，提高兩病毒介體獲毒能力，加劇兩病毒的流行。
　　3.兩病毒復(fù)合侵染導(dǎo)致水稻更嚴(yán)重的細(xì)胞病理學(xué)變化。透射電鏡觀察表明，無(wú)論是病程早（9d）、中（15d）和晚（20d）期，SRBSDV和RRSV復(fù)合侵染均比單獨(dú)侵染引致更嚴(yán)重的細(xì)胞病理學(xué)變化，主要表現(xiàn)在病株上部第一平展葉韌皮部細(xì)胞內(nèi)的病毒粒體數(shù)量和病毒基質(zhì)數(shù)量均顯著增多；葉肉細(xì)胞中葉綠體腫大更為嚴(yán)重，線粒體數(shù)量和嗜鋨顆粒數(shù)量均顯著增加，脂滴增大更為明顯，反映了兩病

7、毒協(xié)生需消耗更多能量，寄主脂類代謝嚴(yán)重受阻，細(xì)胞器受損更為嚴(yán)重。
　　4.兩病毒復(fù)合侵染對(duì)水稻RNA沉默途徑關(guān)鍵蛋白基因表達(dá)模式的影響明顯不同于單獨(dú)侵染。采用RT-qPCR分析了感病水稻植株8個(gè)DCL(OsDCLs),19個(gè)AGO(OsAGOs)以及5個(gè)RDR(OsRDRs)的表達(dá)水平，結(jié)果表明，兩病毒單獨(dú)及復(fù)合侵染均會(huì)導(dǎo)致OsAGO11及OsAGO18的表達(dá)上調(diào)，其中復(fù)合侵染時(shí)OsAGO11的上調(diào)幅度顯著大于SRBSDV單獨(dú)侵染

8、，在病程9d、15d和20d時(shí)，分別是SRBSDV單獨(dú)侵染時(shí)的1.26倍、1.55倍和1.83倍；但與RRSV單獨(dú)侵染時(shí)表達(dá)量差異不顯著。OsAGO18的表達(dá)，在復(fù)合侵染與兩病毒單獨(dú)侵染之間不存在顯著差異。兩病毒單獨(dú)侵染對(duì)8個(gè)OsDCLs的表達(dá)均不造成顯著影響，但復(fù)合侵染時(shí)有時(shí)3個(gè)OsDCLs（OsDCL2a、OsDCL3b和 OsDCL4）的表達(dá)被顯著上調(diào)。兩種病毒單獨(dú)及復(fù)合侵染均使OsRDR1及OsRDR4表達(dá)上調(diào)，而復(fù)合侵染時(shí)兩者

9、的上調(diào)幅度顯著升高，在病程9d、15d和20d時(shí)，復(fù)合侵染植株中OsRDR1的表達(dá)分別是SRBSDV單獨(dú)侵染時(shí)的7.81、9.00和9.98倍，是RRSV單獨(dú)侵染時(shí)的8.35、9.69和10.14倍；OsRDR4的表達(dá)分別是SRBSDV單獨(dú)侵染時(shí)的4.56、9.11和10.76倍，是RRSV單獨(dú)侵染時(shí)的4.82、5.56和5.83倍。表明SRBSDV和RRSV協(xié)生深刻影響了水稻RNA沉默路徑。
　　5.兩病毒RNA沉默抑制子的功能

10、具有加性效應(yīng)。利用農(nóng)桿菌共浸潤(rùn)的方法，以轉(zhuǎn)GFP基因本生煙16c為材料，分析了SRBSDV的沉默抑制子SP6和RRSV的沉默抑制子RP6單獨(dú)及復(fù)合作用對(duì)GFP沉默抑制的活性。注射后1d，SP6和RP6單獨(dú)處理分別僅19.83%和30.42%的浸潤(rùn)區(qū)域觀察到微弱的綠色熒光，而兩者復(fù)合處理則有高達(dá)89.02%的浸潤(rùn)區(qū)域觀察到明顯的綠色熒光；同時(shí)，復(fù)合處理浸潤(rùn)區(qū)域GFP mRNA表達(dá)水平顯著高于SP6和RP6單獨(dú)處理浸潤(rùn)區(qū)域，分別是后兩者的3

11、.36倍和3.18倍。注射后2d，各處理的綠色熒光信號(hào)均達(dá)到最強(qiáng)，復(fù)合浸潤(rùn)區(qū)域GFP mRNA表達(dá)量分別是SP6和RP6單獨(dú)浸潤(rùn)區(qū)域的1.12倍和1.14倍，但差異不顯著。注射后3d，SP6和RP6單獨(dú)浸潤(rùn)的區(qū)域綠色熒光信號(hào)開(kāi)始減弱，而兩者復(fù)合浸潤(rùn)區(qū)域仍保持明顯的綠色熒光；同時(shí)，復(fù)合浸潤(rùn)區(qū)域GFP mRNA表達(dá)量分別是SP6和RP6單獨(dú)浸潤(rùn)區(qū)域的2.04倍和1.39倍，差異顯著。結(jié)果表明，RP6比SP6抑制效果更強(qiáng)，而兩病毒沉默抑制子的