水稻矮縮病毒和水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體的制備及其應(yīng)用.pdf

1、以單克隆抗體為核心建立的血清學(xué)方法操作簡單、特異性好、靈敏度高，適用于田間樣品的大量檢測，因此被廣泛地應(yīng)用于植物病害的診斷、病害流行規(guī)律的分析、預(yù)測預(yù)報(bào)和抗病育種等方面。所以制備出靈敏度高、特異性好的單克隆抗體對農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)和研究具有重要意義。水稻矮縮病毒（Rice dwarfvirus，RDV）在水稻上引起水稻矮縮病;水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streakeddwarf virus，RBSDV）在水稻上引起水稻黑條矮縮病，

2、在玉米上引起玉米粗縮病，還能在小麥上引起小麥綠矮病。目前這兩種病毒病嚴(yán)重影響我國的糧食生產(chǎn)。本試驗(yàn)分別制備了抗RDV和RBSDV單克隆抗體(Monoclonal antibodies，MAbs)，并以單抗為核心建立了相應(yīng)的血清學(xué)檢測方法。
　　 (1)抗RDV單克隆抗體的制備及其檢測應(yīng)用:用提純的RDV病毒粒子免疫BALB/C小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選與克隆等雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，獲得3株能穩(wěn)定傳代并分泌抗RDV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株（

3、1D11、6A8和9B2）。制備的三個(gè)抗RDV單抗具有特異性好、靈敏度高的特點(diǎn)，以它們?yōu)楹诵慕⒘藱z測RDV的Antigen-coated plate enzyme-linked immunosorbent assay(ACP-ELISA)、dot enzyme-linked immunosorbent assay(dot-ELISA)和Immunocapture reversetranscriptase polymerase chai

4、n reaction(IC-RT-PCR)的血清學(xué)方法。靈敏度分析表明:ACP-ELISA、dot-ELISA和IC-RT-PCR檢測水稻病葉的靈敏度分別達(dá)到1∶81，920，1∶10，240和1∶655，360(w/v，g/mL)，而檢測黑尾葉蟬的靈敏度分別達(dá)到1∶25，600，1∶6，400和1∶3，276，800(頭/μL)。利用建立的血清學(xué)方法對從中國10個(gè)省份采集的878個(gè)水稻樣品和531頭黑尾葉蟬進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)RDV

5、僅在云南省發(fā)生流行，云南水稻樣品帶毒率為30％，黑尾葉蟬帶毒率為13.7％。
　　 (2)抗RBSDV單克隆抗體的制備及其檢測應(yīng)用:用粗提純的RBSDV病毒粒子免疫BALB/C小鼠，利用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)最終獲得3株能穩(wěn)定傳代并分泌抗RBSDV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株（5G5、12E10和18F10）。以制備的抗RBSDV單抗為核心建立檢測RBSDV的ACP-ELISA和dot-ELISA兩種血清學(xué)方法操作簡單、準(zhǔn)確性高、特異性好，

6、能有效地區(qū)分在基因序列、病毒粒子形態(tài)、寄主范圍、致病癥狀等多方面都有著高度相似性的RBSDV和南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus， SRBSDV）。靈敏度分析表明:其中ACP-ELISA方法對水稻、玉米、小麥病葉以及灰飛虱中RBSDV的檢測靈敏度分別可達(dá)1∶20，480、1∶81，920、1∶10，240(w/v，g/mL)和1∶19，200(頭/μL)。而dot-EL