南方水稻黑條矮縮病毒分子檢測方法的研究.pdf

1、南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV)為呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟病毒屬（Fiifivirus）第2組的一個建議新種。主要由白背飛虱Sogatella furcifera)以持久性不經(jīng)卵方式傳播，侵染水稻、玉米等引起南方水稻黑條矮縮病和玉米粗縮病。疑似病株的田間診斷及白背飛虱帶毒率測定是病害流行預測的重要因子。當前常用的方法，如生物學方法、免疫

2、學方法、分子生物學方法，存在耗時長、操作復雜及成本高等缺陷，難以滿足快速、準確、低成本的檢測要求，也不能實現(xiàn)病毒RNA拷貝數(shù)的定量。另外，感染SRBSDV的水稻植株與水稻黑條矮縮病表現(xiàn)類似癥狀，且在基因組序列、病毒粒體形態(tài)、癥狀、寄主范圍、傳毒介體及血清學等方面也非常相似，傳統(tǒng)檢測方法很難將它們區(qū)分。有必要建立適用于不同要求和場所的檢測方法來滿足實際需求。
　　 為了滿足快速、簡便、低成本、高特異的要求，本研究建立了逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導

3、等溫擴增方法（RT-LAMP）。針對SRBSDV S9核苷酸序列保守區(qū)域設計4條LAMP特異性引物（F3，B3，F(xiàn)IP, BIP），從引物濃度、MgSO4濃度及反應溫度、時間幾個方面對RT-LAMP方法進行優(yōu)化。確定引物濃度比為1∶8（F3/B3終濃度0.2μM，F(xiàn)IP/BIP終濃度1.6μM），MgSO4終濃度8mM，60-62℃恒溫反應60 min為適宜實驗條件。本RT-LAMP方法的靈敏性是RT-PCR方法的10倍，能夠排除RBS

4、DV的干擾而特異的檢測SRBSDV，適合寄主植物和介體體內(nèi)SRBSDV的快速檢測。
　　 為了實現(xiàn)病毒RNA拷貝數(shù)的準確定量，本研究建立了Real time RT-PCR檢測方法。根據(jù)SRBSDV S9核苷酸序列的保守區(qū)域設計2條特異性引物(SRBSDV-S9-F和SRBSDV-S9-R)。制備重組質(zhì)粒pGEM-T easy-S9，通過體外轉(zhuǎn)錄與純化制備RNA標準品。優(yōu)化引物濃度、退火-延伸溫度，確定引物終濃度為300 nM，退

5、火-延伸溫度60.0℃。體外轉(zhuǎn)錄獲得的RNA標準品經(jīng)10倍系列梯度稀釋，制作標準曲線，進一步測定擴增產(chǎn)物的溶解溫度獲得熔點曲線。標準曲線的R2為0.996，擴增效率為100.2％，熔點曲線峰單一尖銳，說明擴增產(chǎn)物單一，特異性強。靈敏性測驗發(fā)現(xiàn)該方法靈敏性高，比常規(guī)RT-PCR方法高100倍，可實際應用于病毒拷貝數(shù)的準確定量，為SRBSDV的致病機制、分子生物學研究等奠定了基礎。
　　 為評價SRBSDV幾種檢測方法的適用范圍，本