水稻對(duì)水稻黑條矮縮病毒的反應(yīng)和抗性轉(zhuǎn)基因水稻培育研究.pdf

1、水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟(jì)病毒屬（Fijivirus），會(huì)引起水稻黑條矮縮和玉米粗縮病，導(dǎo)致在中國、日本、韓國和其他亞洲國家農(nóng)作物產(chǎn)量嚴(yán)重?fù)p失。感染了水稻黑條矮縮病毒后水稻的主要表現(xiàn)為葉色濃綠，背部葉脈和莖稈上初現(xiàn)蠟白色，后變成褐色的短條瘤狀隆起。水稻黑條矮縮病是由灰飛虱為傳播介體昆蟲的一種病毒病。RBSDV粒子是由直徑大約在75-80納米之間的雙層粒子以及S1到S10的10條雙鏈RNA組

2、成的二十面體結(jié)構(gòu)。
　　盡管人們致力于揭示病毒與宿主之間的相互作用關(guān)系，但到目前為止，水稻黑條矮縮病的發(fā)病機(jī)理仍不清楚。為了明確感染RBSDV后水稻轉(zhuǎn)錄組的改變情況，我們對(duì)一個(gè)易感水稻品種抗條武育粳3號(hào)(KTWYJ3)進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組測(cè)定。感染了RBSDV的水稻樣本與未感染的健康樣本在典型病害癥狀出現(xiàn)后的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣（兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品分別用組Ⅰ和組Ⅱ表示），并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組比較。第Ⅰ組中感染RBSDV的樣本與健康樣本中有281個(gè)顯著差

3、異表達(dá)基因(DEGs)，其中102個(gè)基因上調(diào)，179個(gè)基因下調(diào)。第Ⅱ組中有2592個(gè)DEGs，其中1588個(gè)基因上調(diào)，1004個(gè)基因下調(diào)。兩組中共有的DEGs有66個(gè)，這66個(gè)DEGs中有36個(gè)DEGs的表達(dá)模式是相似的。進(jìn)一步分析表明，在感染RBSDV后一些與疾病防御和抗逆性相關(guān)的基因（如編碼黃酮醇合成酶和水稻細(xì)胞壁相關(guān)激酶基因OsWAK32）表達(dá)上調(diào)，而與葉綠體相關(guān)的基因（如葉綠素合成酶基因Os0Sg28200.1)表達(dá)下調(diào)。此外，

4、一些與株高相關(guān)的基因（例如丙酮酸激酶基因Os11g05110.1)差異表達(dá)。該結(jié)果表明這些基因可能參與RBSDV引起的矮化癥狀。總之，我們對(duì)水稻感染水稻黑條矮縮病毒后全轉(zhuǎn)錄組分析有助于全面了解水稻與RBSDV相互作用以及水稻黑條矮縮病發(fā)病的生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　為了獲得無選擇標(biāo)記基因的抗黑條矮縮病轉(zhuǎn)基因水稻，我們以編碼水稻黑條矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白P7-2和P8基因S7-2和S8作為RNA干擾(RNAi)的靶標(biāo)。P7-2是一個(gè)F-box蛋

5、白，通過泛素化途徑參與植物和病毒的相互作用，P8是具有轉(zhuǎn)錄抑制活性的病毒粒子核心蛋白。我們采用含有S7-2或S8基因RNAi結(jié)構(gòu)的雙T-DNA載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，獲得了含有目的基因以及潮霉素抗性選擇標(biāo)記基因(HPT)的轉(zhuǎn)基因水稻。從這些轉(zhuǎn)基因水稻后代，獲得了無HPT基因的植株。T5代含有S7-2-RNAi或S8-RNAi的純合轉(zhuǎn)基因系在田間自然條件下經(jīng)帶毒灰飛虱的侵染下表現(xiàn)出高抗水稻黑條矮縮病毒。這些結(jié)果表明，通過RNA干擾技術(shù)抑制S

6、7-2或S8基因的表達(dá)是一種有效地提高水稻對(duì)黑條矮縮病毒抗性的手段。
　　已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，病毒侵染植物后通過抑制或激活宿主基因轉(zhuǎn)錄可能會(huì)導(dǎo)致明顯的病癥。對(duì)水稻黑條矮縮病毒感染早期引起的基因表達(dá)變化的了解有助于理解水稻黑條矮縮病發(fā)病機(jī)制，并尋找抵抗黑條矮縮病的抗性基因。我們對(duì)接種水稻黑條矮縮病毒后三個(gè)時(shí)間點(diǎn)（3、8和22天）的水稻利用qRT-PCR分析矮縮癥狀相關(guān)基因、防衛(wèi)和脅迫相關(guān)基因、葉綠體和光合作用相關(guān)基因表達(dá)隨時(shí)間的變化情

7、況。研究結(jié)果表明，一些抗病相關(guān)基因和細(xì)胞壁發(fā)育相關(guān)的基因，如纖維素合成(CESA)基因表達(dá)發(fā)生改變，其中CESA1和CESA7基因的表達(dá)下調(diào)，這可能是造成植株矮化的原因之一。因此，引起矮縮癥狀的原因除株高相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生變化外，可能細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和生物合成相關(guān)基因表達(dá)的變化也具一定的作用。與對(duì)照比較，我們發(fā)現(xiàn)丙酮酸激酶基因在接種后3天表達(dá)顯下調(diào)。OsWRKY基因的表達(dá)也發(fā)生顯著變化，例如，OsWRKY78基因的表達(dá)在接種后3天顯著升高，但在

8、第8天顯著降低，到第22天又顯著上調(diào)。另一方面，一些葉綠體和光合作用相關(guān)基因在病毒感染早期表達(dá)顯著降低，其中葉綠體相關(guān)基因的結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果一致。
　　小RNA(microRNA，miRNA)在發(fā)育、非生物脅迫和對(duì)病原體的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。植物小RNA參與病毒感染，這些病毒應(yīng)答的小RNA與其靶基因和病毒致病性有關(guān)。已有研究結(jié)果在水稻不同組織中鑒定一些參與RBSDV感染的小RNA，這些小RNA和其靶基因在水稻受到RBSDV

9、感染后表達(dá)量發(fā)生變化。我們過表達(dá)RBSDV非結(jié)構(gòu)蛋白P7-1和P9-1，即P7-1OvE和P9-1OvE，其目的在于探討P7-1和P9-1對(duì)水稻RBSDV應(yīng)答的小RNA和其靶基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示在T3代轉(zhuǎn)基因水稻中因過表達(dá)P7-1和P9-1，一些病毒應(yīng)答小RNA靶基因表達(dá)發(fā)生改變。如在過表達(dá)P7-1株系中，miR159和miR169靶基因Os01g59660和Os03g48970顯著上調(diào);在過表達(dá)P9-1株系中，miR166靶基因O

10、s03g01890和Os10g33960顯著上調(diào);其中，最顯著變化的是在過表達(dá)P7-1株系中miR171靶基因Os02g44370表達(dá)量的變化，上調(diào)超過3倍，其編碼scarecrow-like轉(zhuǎn)錄因子。水稻黑條矮縮病毒應(yīng)答小RNA靶基因表達(dá)量的變化表明這些小RNA表達(dá)的變化可能會(huì)干擾其對(duì)不同發(fā)育過程的調(diào)節(jié)作用?？傊?，我們的研究從另一個(gè)方面表明非結(jié)構(gòu)蛋白P7-1和P9-1在水稻黑條矮縮病的發(fā)展過程中的重要作用，其參與了病毒與宿主的互作過程