交鏈孢菌激活蛋白抗體制備及免疫檢測(cè).pdf

1、從真菌中提取的植物激活蛋白是一類熱穩(wěn)定蛋白，具有誘導(dǎo)植物抗性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用。本研究進(jìn)行了交鏈孢菌(Alternaria.sp.)激活蛋白(簡(jiǎn)稱ActP)的雙向電泳鑒定、抗體制備，通過(guò)篩選cDNA表達(dá)文庫(kù)，獲得ActP蛋白基因，純化了該基因的表達(dá)蛋白，為深入研究激活蛋白結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。 首次進(jìn)行了交鏈孢菌激活蛋白的雙向分離。通過(guò)比較不同蛋白提取緩沖液，選用2mMEDTA溶液成功提取交鏈孢菌激活蛋白；對(duì)此蛋白進(jìn)行等電

2、聚焦和雙向電泳，確定其pI為4。 特異性ActP35抗體的制備。電泳分離獲得分子量為35kD交鏈孢菌激活蛋白(簡(jiǎn)稱ActP35)，以此為抗原免疫動(dòng)物，制備兔多抗血清。本研究對(duì)斑點(diǎn)固相親和純化方法進(jìn)行了改進(jìn)，消除抗體和大腸桿菌之間的交叉反應(yīng)，成功制備了大量高特異性ActP35抗體。 利用獲得的抗體免疫篩選交鏈孢菌cDNA表達(dá)文庫(kù)。用純化的ActP35蛋白抗體，從交鏈孢菌菌cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選獲得9個(gè)陽(yáng)性克隆，測(cè)序結(jié)果與激

3、活蛋白ActP35質(zhì)譜鑒定肽段序列比較，獲得一個(gè)相似性較高的克隆。將此克隆所含基因(簡(jiǎn)稱actd-2)進(jìn)行表達(dá)，利用鰲合有鎳離子的親和層析柱成功分離、純化表達(dá)蛋白。 首次利用抗體免疫雜交技術(shù)研究交鏈菌激活蛋白和植物蛋白的互作蛋白。用FarWestern、抗體親和純化的方法研究發(fā)現(xiàn)，證明ActP35蛋白的抗體能夠特異性識(shí)別擬南芥中1，5-二磷酸核酮糖羧化氧化酶，表明兩蛋白可能有相同或相似的氨基酸序列。為激活蛋白作用機(jī)理研究提供證據(jù)