交鏈孢菌激活蛋白激發(fā)水稻的應答基因與抗病性分析.pdf

1、本研究選用從交鏈孢菌(Alternariaspp.)中分離純化出具有促進植物生長、提高植物抗病防蟲性能的蛋白激發(fā)子，就其誘導抗性的作用機理及差異表達基因進行了系列研究： 1)檢測了交鏈孢菌激活蛋白在誘發(fā)水稻幼苗對稻瘟菌抗性中的作用，測定抗性形成過程中兩種重要的活性氧H2O2和O2.-含量及抗病防御相關酶活性的變化，并測定交鏈孢菌激活蛋白對水稻抗病信號途徑關鍵基因轉錄水平的影響。結果表明，水稻幼苗經(jīng)2μgml-1激活蛋白噴霧處理后

2、，5d后葉片的稻瘟菌病情指數(shù)和平均每葉病斑數(shù)開始顯著降低，14d時對稻瘟菌的誘抗效果最為明顯。在激活蛋白處理后的前5dH2O2含量快速上升，7d后明顯下降。O2.-含量的變化趨勢與H2O2含量的變化相似，表現(xiàn)出先升后降的時序變化趨勢?？共》烙嚓P酶PAL、β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質酶活性提高，分別于處理后第7、5、9d活性達到高峰。2μg·ml-1交鏈孢菌激活蛋白處理1d后使水稻幼苗抗病相關基因NPR1和EIN2轉錄活性增強，3d后使

3、CTR1的轉錄受到抑制，但不影響PR4的轉錄。暗示SA和Et兩種信號分子協(xié)同參與了交鏈孢菌激活蛋白誘導水稻幼苗對稻瘟菌的抗性過程。 2)從水稻cDNA文庫中隨機挑取10000個基因，采用cDNA芯片鑒定交鏈孢菌激活蛋白引起水稻幼苗基因表達的變化，半定量RT-PCR和Northern雜交對10個表達增強的抗病防御和信號轉導相關基因表達進行了驗證。2μgml-1激發(fā)子處理5d后，136個基因的表達顯著增強，93個基因的表達明顯受到抑

4、制。此229個差異表達基因中，15個基因可能參與了信號轉導，13個基因參與了抗病防御過程，117個基因是功能不明的新基因，另外的基因則分別參與了轉錄調控、細胞生長與分裂、細胞內轉運、細胞結構、蛋白質合成、加工與儲藏、基礎代謝、次級代謝和能量利用等過程。其中交鏈孢菌激活蛋白誘導了細胞色素P450、調節(jié)蛋白NPR1、抗壞血酸過氧化物酶、sgt1轉錄因子、bZIP轉錄因子、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、酪氨酸磷酸酶、胞質磷酸二脂酶、硫代硫酸硫轉移酶

5、等參與抗病防御和信號轉導的基因的表達。半定量RT-PCR對10個表達增強的抗病防御和信號轉導相關基因(依次命名為OsAiDG1-10)表達進行的驗證表明，除一個基因表達與對照差異不顯著和一個基因的表達受抑制外，其余均與cDNA芯片結果相符。Northernblotting分析驗證兩個差異表達基因OsAiDG3和OsAiDG4的表達模式，結果表現(xiàn)出與cDNA芯片和PCR結果良好的一致性。 3)采用RT-PCR從水稻葉片cDNA中擴

6、增到ORF為1263bp、1530bp的OsAiDG3和OsAiDG4基因。其中，OsAiDG3編碼420aa，分子量為47.2kDa，pI為5.02的蛋白，與許多已知CDPK具有較高同源性。OsAiDG4編碼509aa，分子量為57.1kDa，pI為7.74的蛋白，與許多已知RLK具有較高同源性。將OsAiDG3和OsAiDG4構建到原核表達載體pGEX-6P-1中，轉化大腸桿菌ER2566宿主菌，經(jīng)0.5mmolL-1IPTG誘導4

7、h后，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)分別于73kDa和83kDa位置出現(xiàn)特異性蛋白質條帶，表明實現(xiàn)了目標融合蛋白質的高效表達。 4)為了了解差異表達基因OsAiDG3和OsAiDG4在抗病性中的作用，我們研究了抗病性不同的水稻品種中兩個基因對交鏈孢菌激活蛋白響應的差異，并分別獲得轉OsAiDG3和OsAiDG4基因煙草，檢測轉基因煙草植株中防御相關基因CHI的表達和煙草葉片對TMV的抗性。Northern雜交檢測發(fā)現(xiàn)，1312(稻瘟病

8、抗性品系)和原豐早(稻瘟病敏感品系)中OsAiDG4的表達豐度均較高，OsAiDG3的表達豐度相對較低，交鏈孢菌激活蛋白處理明顯誘導了抗性品系中兩個基因的表達，而敏感品系基因的表達影響不大，推測不同品種間蛋白激酶對激發(fā)子響應的差異可能是決定不同品種稻瘟菌抗性差異的原因之一。將OsAiDG3和OsAiDG4分別構建到植物表達載體PBI121上，采用農桿菌介導的轉化法轉化煙草葉盤，PCR檢測顯示成功獲得轉OsAiDG3和OsAiDG4基因煙