斑污擬盤多毛孢菌激活蛋白的分離純化及其生物活性的研究.pdf

1、激活蛋白(Activator protein)是從多種病原真菌中分離的具有誘導(dǎo)植物抗病性、增強抗逆能力、促進植物生長等生物活性的一類新型蛋白激發(fā)子。激活蛋白能顯著增強植株對多種重要植物病原體的系統(tǒng)廣譜抗性，且其誘抗效力強。目前對斑污擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsis maculans(Cda.) Nag Raj）菌絲體內(nèi)胞內(nèi)可溶性激活蛋白的研究尚未見報道。本研究以斑污擬盤多毛孢菌為實驗材料，通過硫酸銨分級分段沉淀結(jié)合凝膠過濾層析

2、，從斑污擬盤多毛孢菌菌絲體中分離純化獲得分子量17.7kDa有激活生物活性的蛋白。生物活性測定表明，該蛋白可顯著提高玉米、白菜、黃瓜、豌豆種子的發(fā)芽率和根長生長，并可促進豌豆、玉米幼苗植株生長，提高豌豆、玉米幼苗葉片葉綠素含量，提高豌豆、玉米幼苗的根冠比和根系活力。本研究獲得了以下研究成果:
　　1.通過用濾液和蛋白粗提液處理玉米、白菜、黃瓜、豌豆種子，發(fā)現(xiàn)斑污擬盤多毛孢菌能夠產(chǎn)生可以促進一些種子萌發(fā)和根長生長的有激活生物活性的成

3、分，并且此激活成分存在于蛋白粗提液中。本研究采用硫酸銨分級沉淀法對蛋白粗提液進行鹽析，然后對硫酸銨沉淀所得上清液和沉淀進行生測，生測結(jié)果顯示上清液沒有活性，沉淀有活性，證明活性物質(zhì)存在于沉淀中，說明有激活活性的物質(zhì)可能屬于大分子類蛋白質(zhì)，可能是斑污擬盤多毛孢菌菌絲體組成組分的胞內(nèi)可溶性蛋白，從而為進一步分離純化奠定基礎(chǔ)。
　　2.由實驗可知激活蛋白存在于斑污擬盤多毛孢菌菌絲體內(nèi)，為了在最短的時間內(nèi)盡可能地獲取最多的菌絲，本研究從接

4、種量、培養(yǎng)時間、溫度、溶氧量、搖床轉(zhuǎn)速、pH六個因素對斑污擬盤多毛孢菌在振蕩培養(yǎng)條件下產(chǎn)菌絲量進行優(yōu)化選擇。以上六個培養(yǎng)條件分別達到最優(yōu)，組合起來即為最佳振蕩培養(yǎng)條件。實驗得到溫度25℃，pH為6，三個菌餅接種到200mL培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)11d，這樣的培養(yǎng)方案菌絲產(chǎn)量最大且最經(jīng)濟。
　　3.采用硫酸銨分級分段沉淀法對斑污擬盤多毛孢菌蛋白粗提液進行鹽析，得到其鹽析的最適飽和度為60％。此粗提物經(jīng)Sephadex G-75凝膠細柱子層析

5、后得到兩個峰，其中峰2為活性峰。將峰2集中收集濃縮再過Sephadex G-75凝膠粗柱子層析后獲得7個峰，其中峰2-7經(jīng)檢測有活性，SDS-PAGE電泳檢測該峰為單一條帶，以相對遷移率(mR)算得該蛋白的分子量為17.7kDa。
　　4.研究純化蛋白的生物活性，研究其處理種子后對豌豆、玉米的發(fā)芽率，根長生長，植株生長，葉綠素含量，根冠比，根系活力的影響。斑污擬盤多毛孢菌激活蛋白純化樣品處理豌豆、玉米種子后使豌豆、玉米種子的發(fā)芽率