胡黃連苷抑制乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA作用的體外研究.pdf

1、[研究背景]共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)是乙型肝炎病毒(HBV)在細胞內(nèi)復制過程的初始模板,也是病毒在宿主細胞核內(nèi)形成的第一個復制中間體,它的形成標志著病毒在宿主細胞內(nèi)感染狀態(tài)的建立和復制循環(huán)的開始。HBV cccDNA在肝細胞核內(nèi)形成含量相對穩(wěn)定的池,目前絕大多數(shù)臨床上應用的抗HBV藥物均難以清除細胞內(nèi)的cccDNA,被認為是抗病毒治療后乙型肝炎復發(fā)的重要原因。HBV cccDNA的檢測對抗HBV藥物的研發(fā)和應用評價,以及慢性乙

2、型肝炎(CHB)患者的病情監(jiān)測和抗病毒療效評估等具有十分重要的臨床意義。就現(xiàn)有抗HBV藥物的療效看來,尚無能夠迅速抑制或是清除被感染肝細胞內(nèi)HBV cccDNA的治療藥物或方案,針對HBVcccDNA的藥物研發(fā)和療效監(jiān)測工作尚未取得明顯進展。本研究以我們實驗室前期建立的一套特異、靈敏的HBV cccDNA檢測技術(shù)為基礎,在HepG2.2.15細胞平臺上對胡黃連苷促進清除HBV cccDNA的作用效果和特點進行了對比評估,并試圖對相關機制

3、作出初步探討。 本研究共分為三個部分：(一)胡黃連苷促進清除HepG2.2.15細胞內(nèi)HBVcccDNA的作用效果和特點研究。以阿德福韋酯為對照,分別觀察胡黃連苷和阿德福韋酯作用后HepG2.2.1 5細胞培養(yǎng)上清中HBV DNA含量變化,定量檢測細胞內(nèi)HBVDNA、cccDNA和pgRNA水平并計算相應抑制率,比較胡黃連苷與阿德福韋酯作用的不同效果和特點。(二)胡黃連苷對HepG2.2.15細胞內(nèi)HBV cccDNA超螺旋分布

4、的影響。采用專門的二維凝膠電泳方法觀察胡黃連苷作用前后HepG2.2.15細胞內(nèi)HBV cccDNA超螺旋數(shù)量分布有無變化,并與阿德福韋酯作用結(jié)果相對比,利用非參數(shù)秩和檢驗方法進行統(tǒng)計分析,探尋胡黃連苷對HBV cccDNA超螺旋數(shù)量分布的影響。(三)胡黃連苷對HepG2.2.15細胞內(nèi)OAS1、STAT2、ISGF3γ、MyD88、MxA等候選基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。對于胡黃連苷作用后有明顯差異轉(zhuǎn)錄的基因再以siRNA技術(shù)選擇性沉默阻斷,

5、以反向驗證相關基因參與胡黃連苷抗HBV作用的可能性。 第一部分：胡黃連苷對HepG2.2.15細胞內(nèi)HBV cccDNA含量的影響 目的:觀察胡黃連苷抑制HepG 2.2.15細胞內(nèi)HBV cccDNA的作用效果及特點。 方法:分別用含胡黃連苷50μg/ml、胡黃連苷100μg/ml或阿德福韋酯5μg/ml的細胞培養(yǎng)液作用于HepG2.2.15細胞,加藥后2d、5d收集細胞及培養(yǎng)上清液,用實時熒光定量PCR方法檢

6、測上清和細胞內(nèi)HBV DNA、細胞內(nèi)HBV cccDNA和pgRNA水平,分別計算抑制率。 結(jié)果:①胡黃連苷50μg/ml作用后2d和5d,上清HBV DNA抑制率分別為49.74％和79.48％；細胞內(nèi)HBV cccDNA抑制率43.55％和 56.43％,rcDNA抑制率43.39％和63.86％,pgRNA抑制率54.72％和56.08％。②胡黃連苷100μg/ml作用后2d和5d,上清HBV DNA抑制率分別為51.11

7、％和82.07％；細胞內(nèi)HBVcccDNA抑制率41.13％和57.59％,rcDNA抑制率45.09％和67.31％,pgRNA抑制率52.68％和52.47％。③阿德福韋酯作用后2d和5d,上清HBV DNA抑制率分別為25.56％和92.44％；細胞內(nèi)HBV cccDNA抑制率18.54％和47.19％,rcDNA抑制率21.20％和71.47％,pgRNA抑制率11.14％和37.61％。 結(jié)論:胡黃連苷能夠明顯抑制He

8、pG2.2.15細胞內(nèi)HBV復制水平,對HBV cccDNA也具有抑制作用,而且在作用時相上早于阿德福韋酯,可能存在不同的作用機制。 第二部分:胡黃連苷對HepG2.2.15細胞內(nèi)HBV cccDNA超螺旋分布的影響 目的:觀察HepG2.2.15細胞內(nèi)HBV cccDNA超螺旋數(shù)量分布規(guī)律及胡黃連苷、阿德福韋酯對其影響。 方法:實驗共分3組,分別用含胡黃連苷50μg/ml、阿德福韋酯5μg/ml和空白細胞培養(yǎng)液

9、作用于HepG2.2.15細胞,加藥后2d、5d收集細胞,提取細胞內(nèi)HBV cccDNA,經(jīng)二維凝膠電泳分離含有不同超螺旋數(shù)量的cccDNA,轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜與32P-dCTP標記的HBV DNA探針雜交、放射顯影。凝膠成像系統(tǒng)掃描A(0～5個超螺旋)、B(6～10個超螺旋)、C(11～15個超螺旋)、D(16～20個超螺旋)區(qū)域條帶灰度值,計算各區(qū)域灰度積分值所占構(gòu)成比,用非參數(shù)秩和檢驗方法分析組間差異。 結(jié)果:①用藥2d時胡

10、黃連苷組各區(qū)構(gòu)成比中位值為A 14.94％、B 33.32％、C 35.96％、D 14.05％,阿德福韋酯組各區(qū)構(gòu)成比中位值為A 13.00％、B20.04％、C 25.55％、D 39.04％,空白對照組各區(qū)構(gòu)成比中位值為A 12.36％、B21.04％、C 23.22％、D 40.77％。其中胡黃連苷組分別與空白對照組和阿德福韋酯組cccDNA超螺旋分布有統(tǒng)計學差異(Nemenyi檢驗,χ21,3=12.86,X21,2=8.28

11、,P<0.01),而阿德福韋酯組與空白對照組cccDNA超螺旋分布差異無統(tǒng)計學意義(χ22,3=2.58,P>0.25)。②用藥5d時胡黃連苷組各區(qū)構(gòu)成比中位值為A 15.40％、B 33.48％、C 34.47％、D 15.07％,阿德福韋酯組各區(qū)構(gòu)成比中位值為A 13.30％、B 20.52％、C 23.22％、D 42.12％,空白對照組各區(qū)構(gòu)成比中位值為A 13.02％、B 21.24％、C 22.91％、D40.61％。其中胡

12、黃連苷組分別空白對照組和阿德福韋酯組cccDNA超螺旋分布有統(tǒng)計學差異(Nemenyi檢驗,χ21,3=11.61,χ21,2=9.58,P<0.01),阿德福韋酯組與空白對照組cccDNA超螺旋分布差異無統(tǒng)計學意義(χ22,3=0.86,P>0.75)。③空白對照組HepG2.2.1 5細胞內(nèi)HBV cccDNA分子所含超螺旋數(shù)量分布并不均勻,以D區(qū)所占比例最多(約40％),B區(qū)和C區(qū)次之(各約20％),A區(qū)最少,2d和5d間數(shù)據(jù)分布

13、差異沒有顯著性(Mann-Whitney U檢驗,U=0.321,P=0.748)。 結(jié)論:HepG2.2.15細胞內(nèi)HBV cccDNA超螺旋數(shù)量呈現(xiàn)相對固定的異質(zhì)性分布狀態(tài),阿德福韋酯處理2d和5d均未改變分布規(guī)律；胡黃連苷能夠減少HepG2.2.15細胞內(nèi)HBV cccDNA內(nèi)部超螺旋數(shù)量,可能導致cccDNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的減低,促進HBV cccDNA的清除。 第三部分:胡黃連苷對HepG2.2.15細胞內(nèi)部分基因

14、轉(zhuǎn)錄水平的影響 目的:觀察胡黃連苷能否影響HepG2.2.15細胞內(nèi)部分候選基因的轉(zhuǎn)錄,探討其與抗HBV效應的關系。 方法:①選取既往報道的能夠促進感染細胞內(nèi)HBV pgRNA降解的部分基因如2',5'-寡腺苷酸合成酶1(OAS1)、信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄活化因子2(STAT2)、干擾素刺激基因因子3γ(ISGF3γ)、髓樣細胞分化蛋白(MyD88)和MxA蛋白作為候選基因,實時熒光定量RT-PCR方法檢測胡黃連苷作用后48h

15、HepG2.2.15細胞內(nèi)OAS1、STAT2、ISGF3γ、MyD88和MxA基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA水平變化,以β-actin基因mRNA作為檢測內(nèi)參照。②用MyD88 siRNA誘導沉默HepG2.2.15細胞內(nèi)MyD88基因轉(zhuǎn)錄,實時熒光定量PCR方法檢測胡黃連苷作用下HepG2.2.15細胞內(nèi)MyD88 mRNA、HBV pgRNA及培養(yǎng)上清中HBV DNA水平變化。③用MyD88siRNA誘導沉默HepG2.2.15細胞內(nèi)MyD

16、88基因轉(zhuǎn)錄,實時熒光定量PCR方法檢測胡黃連苷作用下HepG2.2.15細胞內(nèi)MyD88 mRNA、HBV cccDNA水平變化,二維電泳方法觀察cccDNA超螺旋分布情況并作組間比較。 結(jié)論:胡黃連苷作用可以誘導HepG2.2.15細胞內(nèi)MyD88基因活躍轉(zhuǎn)錄,并通過MyD88途徑促進HBV pgRNA的降解。但是MyD88并未參與胡黃連苷早期抑制HBV cccDNA的過程,胡黃連苷體外抑制HBV cccDNA、減少HepG