乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)準種特性分析及耐藥相關(guān)位點變異觀察.pdf

1、研究病毒準種及其耐藥種群的動態(tài)分布，是闡明病毒耐藥和病毒學突破發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵所在。
　　 本文主要從兩部分進行研究：
　　 一、未抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者肝內(nèi)HBVcccDNA和血清HBVDNA逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase，RT)區(qū)準種特性的比較分析；
　　 二、慢性乙型肝炎患者治療前后肝內(nèi)HBV cccDNA耐藥相關(guān)位點變異的觀察。
　　 第一部分未抗病毒治療的慢性乙型肝炎

2、患者肝內(nèi)HBV cccDNA和血清HBV DNA RT區(qū)準種特性的比較分析
　　 目的：
　　 了解未經(jīng)核苷類似物抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者肝內(nèi)HBV cccDNA和血清HBV DNA RT區(qū)準種的組成情況以及兩者之間的關(guān)系。
　　 方法：
　　 納入26例未經(jīng)核苷類似物抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者，留取其肝穿組織和血清，并分別抽提肝組織HBV tDNA和血清HBV DNA；先以不降解質(zhì)粒的ATP依賴D

3、NA酶(PSAD)酶切純化肝組織HBVtDNA，利用實時熒光定量PCR法定量肝內(nèi)HBV cccDNA和血清HBV DNA，根據(jù)定量結(jié)果，以跨雙缺口引物行巢式聚合酶鏈反應(PCR)擴增HBV cccDNA的RT區(qū)，以非跨雙缺口引物行巢式PCR擴增血清HBV DNA的RT區(qū)；應用瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，然后對目的片段進行克隆，主要包括重組質(zhì)粒的構(gòu)建、小量制備、酶切鑒定，最后對目的片段進行直接測序；根據(jù)測序結(jié)果，分析肝內(nèi)HBV cccDN

4、A和血清HBV DNA RT區(qū)準種的組成并比較分析兩者間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 肝內(nèi)HBV cccDNART區(qū)準種數(shù)為4～22，血清HBV DNA RT區(qū)準種數(shù)為3～20,肝內(nèi)HBV cccDNA RT區(qū)和血清HBV RT區(qū)兩者的準種數(shù)差異尚無統(tǒng)計學意義(p>0.05)；肝內(nèi)HBV cccDNA和血清HBV DNA RT區(qū)優(yōu)勢準種核苷酸序列部分(5/26例)一致，部分(21/26例)不一致；肝內(nèi)HBV cccDNA

5、和血清HBV DNA RT區(qū)準種復雜度在核苷酸水平和氨基酸水平的差異均無統(tǒng)計學意義(p>0.05)；肝內(nèi)HBV cccDNA和血清HBV DNA RT區(qū)準種多樣性在核苷酸水平和氨基酸水平的差異均無統(tǒng)計學差異(p>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、證實了肝內(nèi)HBV cccDNA準種的存在。
　　 2.在未經(jīng)抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者肝內(nèi)HBV cccDNA和血清HBV DNA RT區(qū)準種數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義；

6、肝內(nèi)HBV cccDNA和血清HBV DNA RT區(qū)優(yōu)勢準種不完全一致；兩者準種復雜度和多樣性之間差異無統(tǒng)計學意義。
　　 第二部分慢性乙型肝炎患者治療前后肝內(nèi)HBV cccDNA耐藥相關(guān)位點變異的觀察
　　 目的：
　　 了解慢性乙型肝炎患者肝內(nèi)HBV cccDNA耐藥相關(guān)位點自然變異的發(fā)生情況及抗病毒治療前后，肝內(nèi)HBV cccDNA耐藥相關(guān)變異位點野生型與變異型所占比例變化情況。
　　 方法：

7、>　　 納入了13例間隔約12月先后兩次肝穿的慢性乙型肝炎患者，抽提冰凍肝組織獲得HBV DNA抽提液，通過酶切純化、熒光定量PCR法定量肝內(nèi)HBV cccDNA和血清HBV DNA；應用PCR、巢式PCR和直接測序法檢測治療前后肝內(nèi)HBV cccDNA耐藥相關(guān)位點變異；對肝內(nèi)HBV cccDNA的RT區(qū)克隆測序分析。
　　 結(jié)果：
　　 發(fā)現(xiàn)3例(3/13)存在肝內(nèi)HBV cccDNA耐藥相關(guān)位點自然變異；發(fā)現(xiàn)1例(