替拉那韋對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制的抑制作用研究.pdf_第1頁(yè)
已閱讀1頁(yè),還剩64頁(yè)未讀 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

1、背景:乙型肝炎是人類(lèi)健康的嚴(yán)重威脅,引起乙肝的病原體是乙型肝炎病毒(HBV)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織所進(jìn)行的調(diào)查統(tǒng)計(jì),全球范圍內(nèi)乙肝的發(fā)病率快速增長(zhǎng),已經(jīng)有超過(guò)3億人感染HBV,中國(guó)感染HBV的患者數(shù)量眾多,約有1億乙肝患者,且乙肝病毒感染造成的肝臟損傷十分嚴(yán)重,加之乙型肝炎引發(fā)的繼發(fā)疾?。ǜ喂δ芩ソ?、肝癌等)死亡率較高,使其成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的問(wèn)題。
  抗病毒治療是乙型肝炎治療的關(guān)鍵,其主要策略是最大限度地有效抑制HBV增殖,防止

2、病毒進(jìn)一步損傷肝臟細(xì)胞,破壞肝臟的生理代謝功能,減少其引發(fā)更嚴(yán)重的肝臟疾病,從而使乙型肝炎患者的病情得到控制。目前,臨床常用治療乙肝的抗病毒藥物有核苷類(lèi)似物(拉米夫定、阿得福韋酯、恩替卡韋、替比夫定等),干擾素(主要是α-干擾素)和免疫調(diào)節(jié)劑(左旋咪唑、糖皮質(zhì)激素、白細(xì)胞介素2、乙肝免疫球蛋白等)。核苷類(lèi)似物是目前臨床上抗病毒最有效的藥物,其作用機(jī)制是通過(guò)抑制病毒的DNA多聚酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的活性達(dá)到抑制病毒復(fù)制的效果,但一旦HBV病毒DN

3、A多聚酶發(fā)生變異就會(huì)導(dǎo)致耐藥,且停藥后病情容易反彈和復(fù)發(fā)。而干擾素和免疫調(diào)節(jié)劑有嚴(yán)重的副作用。因此,有必要針對(duì)新靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)能有效抑制HBV轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的新型乙肝治療藥物。
  眾所周知,病毒自身由于沒(méi)有實(shí)現(xiàn)新陳代謝所必需的基本成分,病毒自身不能復(fù)制。當(dāng)病毒感染宿主細(xì)胞時(shí),會(huì)脫去蛋白質(zhì)外套,其核酸進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi),借助宿主細(xì)胞的關(guān)鍵分子,按照病毒基因的指令產(chǎn)生新的病毒。通過(guò)干預(yù)宿主細(xì)胞的關(guān)鍵分子來(lái)抑制病毒的復(fù)制是尋找新型乙肝治療性藥物的重

4、要方向,宿主細(xì)胞關(guān)鍵靶標(biāo)分子的選擇是藥物篩選的前提。SIRT1是近年來(lái)病理學(xué)研究的熱點(diǎn),它作為第Ⅲ類(lèi)組蛋白去乙?;?,通過(guò)去乙?;揎椀姆绞秸{(diào)節(jié)基因表達(dá)。SIRT1的生理作用十分廣泛,主要參與調(diào)控細(xì)胞的生理周期、細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)以及細(xì)胞內(nèi)的多種代謝反應(yīng),對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)及各種生理功能的調(diào)節(jié)起重要作用。
  SIRT1作為第Ⅲ類(lèi)組蛋白去乙?;福彩切纬蒆BV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)的微型染色體的一個(gè)結(jié)構(gòu)組件,并且Patri

5、ce André等學(xué)者的研究證實(shí)了在SIRT1激活劑作用下,SIRT1與法尼酯X受體(FXR)、過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體(PPARs)協(xié)同作用可使得乙肝病毒RNA的合成大幅增多,我國(guó)學(xué)者黃愛(ài)龍等也證實(shí)了SIRT1沉默能顯著地抑制HBV復(fù)制中間體、3.5kb的mRNA和核心蛋白的表達(dá),且SIRT1抑制劑對(duì)HBV復(fù)制中間體等有抑制作用。以上研究表明,SIRT1確實(shí)參與了乙肝病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制,提示SIRT1有望成為乙型病毒性肝炎治療的新靶標(biāo)

6、。
  然而,以SIRT1為靶標(biāo)的抗HBV藥物還未有相關(guān)報(bào)道。替拉那韋是一種已經(jīng)用于臨床的抗病毒藥物,本實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明替拉那韋具有SIRT1抑制活性。因而,研究替拉那韋對(duì)乙型肝炎病毒的抑制作用很有意義。
  目的:本項(xiàng)目將不同濃度的替拉那韋作用于轉(zhuǎn)染了乙肝病毒的細(xì)胞,以拉米夫定和sirtinol作為陽(yáng)性對(duì)照,驗(yàn)證替拉那韋在體外對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制的抑制作用,分別驗(yàn)證替拉那韋在體外對(duì)乙型肝炎病毒DNA復(fù)制及三種乙肝抗原(乙

7、肝表面抗原、乙肝e抗原和乙肝核心抗原)表達(dá)的抑制作用。并進(jìn)一步檢測(cè)替拉那韋對(duì)乙肝病毒復(fù)制相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響,初步探討替拉那韋抑制乙肝病毒復(fù)制的作用機(jī)制。
  研究?jī)?nèi)容:
  1.替拉那韋的細(xì)胞毒性研究
  ①驗(yàn)證替拉那韋對(duì)肝臟細(xì)胞的毒性,CCK-8法檢測(cè)替拉那韋對(duì)L02細(xì)胞、Huh-7細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、HepAD38細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞的細(xì)胞毒性,計(jì)算增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度,比較替拉那韋對(duì)不同肝臟細(xì)胞

8、的細(xì)胞毒性作用;
  ②以L02細(xì)胞、Huh-7細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、HepAD38細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞為靶細(xì)胞,CCK-8法比較替拉那韋與陽(yáng)性對(duì)照藥物:拉米夫定、Sirtinol(SIRT1抑制劑)對(duì)這些細(xì)胞的增殖抑制率。
  2.替拉那韋在DNA水平對(duì)乙肝病毒復(fù)制的抑制作用研究
  驗(yàn)證替拉那韋對(duì)乙型肝炎病毒在體外復(fù)制的影響。以HepAD38細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞為靶細(xì)胞,應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢

9、測(cè)乙肝病毒DNA在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況。
  3.替拉那韋在蛋白水平對(duì)乙肝病毒的抑制作用研究
  驗(yàn)證替拉那韋對(duì)乙型肝炎病毒在體外復(fù)制的影響。以HepAD38細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞為靶細(xì)胞,應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)乙肝病毒抗原(乙肝表面抗原、乙肝e抗原和乙肝核心抗原)的表達(dá)情況。
  4.替拉那韋抑制乙肝病毒復(fù)制的作用機(jī)制的初步研究
  以HepAD38細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞為靶細(xì)胞,應(yīng)用western

10、 blot技術(shù)檢測(cè)替拉那韋對(duì)乙肝病毒復(fù)制的關(guān)鍵分子(sirt1、AP1等)表達(dá)的影響。初步探討替拉那韋抑制乙肝病毒復(fù)制的作用機(jī)制。
  結(jié)果:
  1.通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)替拉那韋的細(xì)胞毒性,結(jié)果表明:替拉那韋對(duì)轉(zhuǎn)染了HBV的HepAD38細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞的細(xì)胞毒性明顯大于未轉(zhuǎn)染HBV的L02細(xì)胞、Huh-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞,其中對(duì)L02細(xì)胞的細(xì)胞毒性最小。替拉那韋對(duì)L02細(xì)胞、Huh-7細(xì)胞、HepG2

11、細(xì)胞、HepAD38細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用呈現(xiàn)明顯的濃度依賴(lài)關(guān)系。并且替拉那韋對(duì)上述細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用比陽(yáng)性對(duì)照藥物(拉米夫定、Sirtinol)對(duì)這些細(xì)胞的細(xì)胞毒性強(qiáng)很多。
  2.運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù),檢測(cè)HBV DNA結(jié)果表明:不同濃度的替拉那韋分別作用于HepG2.2.15細(xì)胞和HepAD38細(xì)胞,替拉那韋能顯著抑制HBV DNA的表達(dá),并呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。濃度為2.5μmol/L的替拉那韋對(duì)HBV

12、DNA的表達(dá)的抑制效果與濃度為25μmol/L的sirtinol或濃度為20μmol/L的拉米夫定相當(dāng)。
  3.運(yùn)用ELISA技術(shù),檢測(cè)乙肝病毒三種抗原的表達(dá),結(jié)果表明:不同濃度的替拉那韋分別作用于HepG2.2.15細(xì)胞和HepAD38細(xì)胞,替拉那韋能顯著抑制HBV三種抗原的表達(dá),并呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。濃度為5μmol/L的替拉那韋對(duì)HBV表面抗原的表達(dá)的抑制作用與濃度為25μmol/L的sirtinol或濃度為20μmol/L的

13、拉米夫定相當(dāng);濃度為10μmol/L的替拉那韋對(duì)HBV e抗原的表達(dá)的抑制作用接近濃度為25μmol/L的sirtinol或濃度為20μmol/L的拉米夫定;濃度為10μmol/L的替拉那韋對(duì)HBV核心抗原的表達(dá)的抑制作用與濃度為25μmol/L的sirtinol或濃度為20μmol/L的拉米夫定相當(dāng)。
  4.運(yùn)用western blot技術(shù),檢測(cè)替拉那韋對(duì)HBV復(fù)制的關(guān)鍵分子:SIRT1、AP1表達(dá)的影響,結(jié)果表明:替拉那韋對(duì)

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論