替拉那韋對乙型肝炎病毒復制的抑制作用研究.pdf

1、背景：乙型肝炎是人類健康的嚴重威脅，引起乙肝的病原體是乙型肝炎病毒（HBV）。根據(jù)世界衛(wèi)生組織所進行的調查統(tǒng)計，全球范圍內乙肝的發(fā)病率快速增長，已經(jīng)有超過3億人感染HBV，中國感染HBV的患者數(shù)量眾多，約有1億乙肝患者，且乙肝病毒感染造成的肝臟損傷十分嚴重，加之乙型肝炎引發(fā)的繼發(fā)疾?。ǜ喂δ芩ソ?、肝癌等）死亡率較高，使其成為嚴重危害人類健康的問題。
　　抗病毒治療是乙型肝炎治療的關鍵，其主要策略是最大限度地有效抑制HBV增殖，防止

2、病毒進一步損傷肝臟細胞，破壞肝臟的生理代謝功能，減少其引發(fā)更嚴重的肝臟疾病，從而使乙型肝炎患者的病情得到控制。目前，臨床常用治療乙肝的抗病毒藥物有核苷類似物（拉米夫定、阿得福韋酯、恩替卡韋、替比夫定等），干擾素（主要是α-干擾素）和免疫調節(jié)劑（左旋咪唑、糖皮質激素、白細胞介素2、乙肝免疫球蛋白等）。核苷類似物是目前臨床上抗病毒最有效的藥物，其作用機制是通過抑制病毒的DNA多聚酶和逆轉錄酶的活性達到抑制病毒復制的效果，但一旦HBV病毒DN

3、A多聚酶發(fā)生變異就會導致耐藥，且停藥后病情容易反彈和復發(fā)。而干擾素和免疫調節(jié)劑有嚴重的副作用。因此，有必要針對新靶點開發(fā)能有效抑制HBV轉錄與復制的新型乙肝治療藥物。
　　眾所周知，病毒自身由于沒有實現(xiàn)新陳代謝所必需的基本成分，病毒自身不能復制。當病毒感染宿主細胞時，會脫去蛋白質外套，其核酸進入宿主細胞內，借助宿主細胞的關鍵分子，按照病毒基因的指令產(chǎn)生新的病毒。通過干預宿主細胞的關鍵分子來抑制病毒的復制是尋找新型乙肝治療性藥物的重

4、要方向,宿主細胞關鍵靶標分子的選擇是藥物篩選的前提。SIRT1是近年來病理學研究的熱點，它作為第Ⅲ類組蛋白去乙?；?，通過去乙酰化修飾的方式調節(jié)基因表達。SIRT1的生理作用十分廣泛，主要參與調控細胞的生理周期、細胞的應激反應以及細胞內的多種代謝反應，對細胞的正常生長及各種生理功能的調節(jié)起重要作用。
　　SIRT1作為第Ⅲ類組蛋白去乙?；福彩切纬蒆BV共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）的微型染色體的一個結構組件，并且Patri

5、ce André等學者的研究證實了在SIRT1激活劑作用下，SIRT1與法尼酯X受體（FXR）、過氧化物酶體增殖物活化受體（PPARs）協(xié)同作用可使得乙肝病毒RNA的合成大幅增多，我國學者黃愛龍等也證實了SIRT1沉默能顯著地抑制HBV復制中間體、3.5kb的mRNA和核心蛋白的表達，且SIRT1抑制劑對HBV復制中間體等有抑制作用。以上研究表明，SIRT1確實參與了乙肝病毒的轉錄與復制，提示SIRT1有望成為乙型病毒性肝炎治療的新靶標

6、。
　　然而，以SIRT1為靶標的抗HBV藥物還未有相關報道。替拉那韋是一種已經(jīng)用于臨床的抗病毒藥物，本實驗室的前期研究表明替拉那韋具有SIRT1抑制活性。因而，研究替拉那韋對乙型肝炎病毒的抑制作用很有意義。
　　目的：本項目將不同濃度的替拉那韋作用于轉染了乙肝病毒的細胞，以拉米夫定和sirtinol作為陽性對照，驗證替拉那韋在體外對乙型肝炎病毒復制的抑制作用，分別驗證替拉那韋在體外對乙型肝炎病毒DNA復制及三種乙肝抗原（乙

7、肝表面抗原、乙肝e抗原和乙肝核心抗原）表達的抑制作用。并進一步檢測替拉那韋對乙肝病毒復制相關蛋白表達量的影響，初步探討替拉那韋抑制乙肝病毒復制的作用機制。
　　研究內容：
　　1.替拉那韋的細胞毒性研究
　?、衮炞C替拉那韋對肝臟細胞的毒性，CCK-8法檢測替拉那韋對L02細胞、Huh-7細胞、HepG2細胞、HepAD38細胞、HepG2.2.15細胞的細胞毒性，計算增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度，比較替拉那韋對不同肝臟細胞

8、的細胞毒性作用；
　?、谝訪02細胞、Huh-7細胞、HepG2細胞、HepAD38細胞、HepG2.2.15細胞為靶細胞，CCK-8法比較替拉那韋與陽性對照藥物:拉米夫定、Sirtinol（SIRT1抑制劑）對這些細胞的增殖抑制率。
　　2.替拉那韋在DNA水平對乙肝病毒復制的抑制作用研究
　　驗證替拉那韋對乙型肝炎病毒在體外復制的影響。以HepAD38細胞、HepG2.2.15細胞為靶細胞，應用熒光定量PCR技術檢

9、測乙肝病毒DNA在細胞內的復制情況。
　　3.替拉那韋在蛋白水平對乙肝病毒的抑制作用研究
　　驗證替拉那韋對乙型肝炎病毒在體外復制的影響。以HepAD38細胞、HepG2.2.15細胞為靶細胞，應用ELISA技術檢測乙肝病毒抗原（乙肝表面抗原、乙肝e抗原和乙肝核心抗原）的表達情況。
　　4.替拉那韋抑制乙肝病毒復制的作用機制的初步研究
　　以HepAD38細胞、HepG2.2.15細胞為靶細胞，應用western

10、 blot技術檢測替拉那韋對乙肝病毒復制的關鍵分子（sirt1、AP1等）表達的影響。初步探討替拉那韋抑制乙肝病毒復制的作用機制。
　　結果：
　　1.通過CCK-8實驗檢測替拉那韋的細胞毒性，結果表明：替拉那韋對轉染了HBV的HepAD38細胞和HepG2.2.15細胞的細胞毒性明顯大于未轉染HBV的L02細胞、Huh-7細胞和HepG2細胞，其中對L02細胞的細胞毒性最小。替拉那韋對L02細胞、Huh-7細胞、HepG2

11、細胞、HepAD38細胞、HepG2.2.15細胞的細胞毒性作用呈現(xiàn)明顯的濃度依賴關系。并且替拉那韋對上述細胞的細胞毒性作用比陽性對照藥物（拉米夫定、Sirtinol）對這些細胞的細胞毒性強很多。
　　2.運用熒光定量PCR技術，檢測HBV DNA結果表明：不同濃度的替拉那韋分別作用于HepG2.2.15細胞和HepAD38細胞，替拉那韋能顯著抑制HBV DNA的表達，并呈現(xiàn)濃度依賴性。濃度為2.5μmol/L的替拉那韋對HBV

12、DNA的表達的抑制效果與濃度為25μmol/L的sirtinol或濃度為20μmol/L的拉米夫定相當。
　　3.運用ELISA技術，檢測乙肝病毒三種抗原的表達，結果表明：不同濃度的替拉那韋分別作用于HepG2.2.15細胞和HepAD38細胞，替拉那韋能顯著抑制HBV三種抗原的表達，并呈現(xiàn)濃度依賴性。濃度為5μmol/L的替拉那韋對HBV表面抗原的表達的抑制作用與濃度為25μmol/L的sirtinol或濃度為20μmol/L的

13、拉米夫定相當;濃度為10μmol/L的替拉那韋對HBV e抗原的表達的抑制作用接近濃度為25μmol/L的sirtinol或濃度為20μmol/L的拉米夫定;濃度為10μmol/L的替拉那韋對HBV核心抗原的表達的抑制作用與濃度為25μmol/L的sirtinol或濃度為20μmol/L的拉米夫定相當。
　　4.運用western blot技術，檢測替拉那韋對HBV復制的關鍵分子:SIRT1、AP1表達的影響，結果表明：替拉那韋對