血清中嗜肝DNA病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA動(dòng)態(tài)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)和臨床研究.pdf

1、本研究以實(shí)驗(yàn)室建立的一套特異、靈敏的HBV cccDNA檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)，分別以不同程度肝損傷的DHBV感染上海麻鴨和乙型肝炎患者為研究對(duì)象，探討在外周血中檢測(cè)cccDNA的可能性及相關(guān)的影響因素。全文共分為三個(gè)部分： (一)乙肝病毒與cccDNA在血液中的清除動(dòng)力學(xué)和穩(wěn)定性比較研究；(二)鴨肝損傷模型血清中鴨乙肝病毒cccDNA的動(dòng)態(tài)檢測(cè)；(三)乙型肝炎患者血清中乙肝病毒cccDNA的動(dòng)態(tài)檢測(cè)。 第一部分乙肝病毒與cccDNA在

2、血液中的清除動(dòng)力學(xué)和穩(wěn)定性比較研究。 目的：以HBV為對(duì)照觀察HBV cccDNA在外周血中的血液動(dòng)力學(xué)特征和穩(wěn)定性，探討在外周血中檢測(cè)cccDNA的可行性。 材料與方法： ①將12只1周齡上海麻鴨隨機(jī)分為A、B兩組，A組和B組每只鴨分別以1.2×10<'9>copies/ml的HBV攜帶者血清和含1.2×10<'9>copies/ml pBS HBV 3.6 Ⅱ質(zhì)粒(模擬cccDNA)的人血清1 ml頸靜脈注射

3、。在注射后0.25 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h和32 h，分別采靜脈血進(jìn)行HBV DNA定量檢測(cè)。 ②將1.2×10<'8>copies/ml的HBV攜帶者血漿和含有1.2×10<'8>copies/ml的pBS HBV3.6 Ⅱ質(zhì)粒(模擬cccDNA)人血漿各50μl，分別用5 U的RQ1 DNase酶處理37℃1 h，并以未加酶處理的相應(yīng)血漿為對(duì)照，觀察核酸酶處理前后血漿中HBV DNA的變化。

4、 ③將1.2×10<'8>copies/ml的HBV攜帶者新鮮血漿和含1.2×10<'8>copies/ml pBS HBV 3.6 Ⅱ質(zhì)粒(模擬cccDNA)的正常人新鮮血漿各1.5 ml分別置于37℃水浴，在水浴后4h、8h、12h、16h、24h、2d、3d、4d、5d、6d和7d，每管分別取100μl血漿進(jìn)行HBV DNA定量檢測(cè)。 結(jié)果： ①HBV和pBS HBV 3.6 Ⅱ質(zhì)粒在鴨血液中載量的動(dòng)態(tài)變化均

5、符合單相指數(shù)衰減曲線模型。在注射后0.25～24 h內(nèi)血液中均可檢測(cè)到HBV和質(zhì)粒(cccDNA)，32 h后則未能檢出。HBV和質(zhì)粒(cccDNA)在鴨血液中的平均半衰期分別為4.536±0.769 h和4.511±0.791 h，二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.9593)； ②在核酸酶處理前后，血漿中的HBV顆粒無(wú)明顯變化，而質(zhì)粒含量則下降了兩個(gè)數(shù)量級(jí)(log<,10>)。但相同量的HBV顆粒和pBS HBV 3.6 Ⅱ質(zhì)粒在體外

6、水浴4h～7d，各時(shí)點(diǎn)血漿中HBV顆粒和質(zhì)粒(cccDNA)的量無(wú)明顯變化(變異系數(shù)分別為1.05％和1.73％)，同一時(shí)點(diǎn)血漿HBV和質(zhì)粒(cccDNA)的量配對(duì)t檢驗(yàn)也無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.8568)。結(jié)論HBV cccDNA在血液中的清除動(dòng)力學(xué)特征和穩(wěn)定性均與HBV相似，血清HBV cccDNA檢測(cè)在技術(shù)上具有可行性。 第二部分鴨肝損傷模型血清中鴨乙肝病毒cccDNA的動(dòng)態(tài)檢測(cè)。 目的：探討在不同程度肝損傷的D

7、HBV感染上海麻鴨外周血中是否能檢測(cè)出DHBV cccDNA。 材料與方法： ①建立由一對(duì)跨缺口的引物和Taqman熒光探針組成的選擇性DHBV cccDNA熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)，用不同濃度的DHBV質(zhì)粒(cccDNA)和純化DHBV rcDNA驗(yàn)證該系統(tǒng)區(qū)分cccDNA和rcDNA的效率；并進(jìn)一步結(jié)合PDS(十二烷基硫酸鉀)-蛋白質(zhì)沉淀法和不降解質(zhì)粒的ATP依賴DNA酶(PSAD)的酶切法降低模板中的rcDNA背景而

8、實(shí)現(xiàn)DHBV cccDNA的特異性擴(kuò)增。 ②用DHBV強(qiáng)陽(yáng)性鴨血清注射40只1日齡上海麻鴨，并在注射后2個(gè)月選擇持續(xù)感染DHBV的上海麻鴨中的24只隨機(jī)分為4組，分別以：A)D-氨基半乳糖(D-GalN)2.2 g/kg+脂多糖(LPS)100μg/kg；B)D-GalN+LPS+10 ml/kg的CCl<,4>灌胃2次；C)D-GalN+LPS+15 ml/kg的CCl<,4>灌胃2次，并用生理鹽水處理另一組動(dòng)物作為正常對(duì)照組

9、(NC組)。在處理后不同時(shí)間點(diǎn)靜脈抽血1ml，分別檢測(cè)血清中的ALT、DHBV載量和DHBV cccDNA，最后處死動(dòng)物取肝組織評(píng)價(jià)肝損傷程度，并檢測(cè)肝組織中的總DHBV DNA和DHBV cccDNA。 結(jié)果： ①選擇性DHBV cccDNA熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)能擴(kuò)增10<'3>～10<'8>copies/ml的DHBV質(zhì)粒(cccDNA)，而以DHBV rcDNA為模板時(shí)，只有10<'7>copies/ml以上的D

10、HBVmDNA才會(huì)出現(xiàn)弱熒光信號(hào)，該系統(tǒng)擴(kuò)增cccDNA的效率是擴(kuò)增rcDNA效率的10<'4>倍；PDS-蛋白質(zhì)沉淀法抽提和PSAD酶切純化可分別使待測(cè)樣品中的rcDNA背景降低1個(gè)數(shù)量級(jí)(log<,10>)而保持cccDNA的含量不變，二者與選擇性熒光定量PCR結(jié)合檢測(cè)10<'8>copies/ml以上的rcDNA均無(wú)陽(yáng)性信號(hào)。 ②NC組鴨無(wú)明顯病理改變，A組、B組和C組鴨則分別出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死至大片肝壞死的肝損傷，3組的肝損傷

11、程度分級(jí)具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.000)。B組和c組在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)分別有1只和4只鴨死亡。NC組和A組各檢測(cè)時(shí)點(diǎn)血清中均未檢測(cè)到DHBV cccDNA；B組和C組在初次CCh處理后12 h分別有2只和3只鴨血清中檢測(cè)到DHBVcccDNA，含量在3.17×10<'3>～1.72×10<'4>copies/ml之間，在初次CCl<,4>處理后24 h兩組各有1只鴨血清中仍可以檢測(cè)出DHBV cccDNA。Logistic逐步回歸分析顯

12、示血清中DHBV cccDNA的檢出率與肝損傷程度評(píng)分有關(guān)(P=0.0029)，而與血清DHBV載量、ALT水平以及肝組織中的總HBV DNA和DHBV cccDNA含量無(wú)關(guān)。 結(jié)論： ①由PDS-蛋白質(zhì)沉淀法抽提、PASD酶切純化和選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR組成的DHBV cccDNA檢測(cè)方法靈敏度高，特異性好； ②在肝組織發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，血清中可以出現(xiàn)DHBV cccDNA。血清中DHBV cccDNA的出現(xiàn)與

13、肝組織損傷程度有關(guān)，而與血清中的ALT水平、血清DHBV載量以及肝組織中總DHBV DNA和cccDNA水平無(wú)關(guān)。 第三部分乙型肝炎患者血清中乙肝病毒cccDNA的動(dòng)態(tài)檢測(cè)。 目的：觀察在不同肝臟病變程度的乙型肝炎外周血中能否檢測(cè)HBV cccDNA。 對(duì)象與方法：以57例住院的乙型肝炎患者為研究對(duì)象，其中輕度慢性乙型肝炎患者(MCHB)26例，重型乙型肝炎(SHB)患者31例。MCHB組每位患者采集血清

14、標(biāo)本1次共獲得26份血清標(biāo)本，SHB組每位患者在病程中的不同時(shí)間采集血清1～5次共獲得60份血清標(biāo)本。每份血清標(biāo)本分別進(jìn)行HBV載量檢測(cè)和HBVcccDNA檢測(cè)，并同時(shí)記錄各血清標(biāo)本采集時(shí)間點(diǎn)患者的凝血酶原時(shí)間(PT)和肝臟生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果。 結(jié)果：①M(fèi)CHB組有1份血清標(biāo)本HBV cccDNA為陽(yáng)性，SHB組有13例患者的13份血清標(biāo)本HBV cccDNA為陽(yáng)性，血清HBV cccDNA的含量1.25×10<'3>～4．88

15、×10<'4> copies/ml之間，兩組患者血清HBV cccDNA的檢出率有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.0014)，但血清HBV cccDNA檢測(cè)診斷SHB的靈敏度僅為41.94％，準(zhǔn)確度僅為66.67％。②Logistic逐步回歸分析顯示，血清HBV cccDNA的檢出率與凝血酶原時(shí)間的長(zhǎng)短有關(guān)(P=0.0072)，而與患者的年齡、性別、血清HBV載量和ALT水平無(wú)顯著相關(guān)性。 結(jié)論：乙型肝炎患者外周血中可以檢測(cè)出HBV c