DsRBM對(duì)草魚PKR抑制蛋白翻譯功能的影響研究.pdf

1、PKR是脊椎動(dòng)物抗病毒免疫反應(yīng)的主要功能蛋白，它可以在病毒感染和其它多種脅迫刺激下，通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細(xì)胞抗病毒免疫反應(yīng)，并且通過(guò)抑制細(xì)胞蛋白合成導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。PKR屬于Ser/Thr蛋白激酶家族，又屬于dsRNA結(jié)合蛋白家族。其分子結(jié)構(gòu)包括N端的dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dsRBD)和C端的激酶活性結(jié)構(gòu)域(Kinase Domian，KD)。其中dsRBD對(duì)KD的激酶活性起著調(diào)節(jié)作用。PKR的dsRBD一般由2個(gè)(哺乳動(dòng)物)或3個(gè)(

2、少數(shù)魚類)dsRNA結(jié)合模體(dsRBM)構(gòu)成。多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，少數(shù)含有3個(gè)dsRBM的魚類PKR的dsRBM在結(jié)構(gòu)上具有很大的相似性，但在進(jìn)化上卻有不同的來(lái)源。
　　本研究對(duì)本實(shí)驗(yàn)室克隆的草魚(Ctenopharyngodon idella)PKR(CiPKR)所含有的3個(gè)dsRBM進(jìn)行了分析和鑒定。CiPKR的dsRBM具有典型的dsRBM的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并含有的與其dsRNA結(jié)合功能密切相關(guān)的保守氨基酸區(qū)域。在C

3、iPKR的3個(gè)dsRBM里面，dsRBM1僅在少數(shù)魚類PKR中發(fā)現(xiàn)；而dsRBM2和dsRBM3在進(jìn)化上分別與哺乳動(dòng)物PKR的dsRBM1和dsRBM2相近。原核表達(dá)單獨(dú)的dsRBM蛋白的二聚化實(shí)驗(yàn)顯示：CiPKR的dsRBM1和dsRBM2不僅能進(jìn)行同二聚化，還能進(jìn)行同多聚化；但是，dsRBM3就像哺乳動(dòng)物dsRBM2一樣，只能進(jìn)行同二聚化，不能進(jìn)行同多聚化；同時(shí)，原核表達(dá)含2個(gè)或3個(gè) dsRBM的dsRBM1-2，dsRBM2-3和

4、dsRBM1-2-3蛋白也是既能進(jìn)行同二聚化，又能進(jìn)行同多聚化。Poly I:C對(duì)原核表達(dá)各dsRBM蛋白的pull-down實(shí)驗(yàn)顯示：?jiǎn)为?dú)一個(gè)dsRBM并不能明顯地與Poly I:C結(jié)合；而含有2個(gè)或3個(gè)dsRBM的蛋白則能明顯地與Poly I:C結(jié)合。
　　為了進(jìn)一步研究dsRBM對(duì)CiPKR激酶活性的影響，本研究設(shè)計(jì)構(gòu)建了一系列含有不同種類和不同數(shù)量的CiPKR突變體，包括CiPKR-ΔdsRBM2-3、CiPKR-ΔdsR

5、BM1,3、CiPKR-ΔdsRBM1-2、CiPKR-ΔdsRBM3、CiPKR-ΔdsRBM1。并將這些重組質(zhì)粒和帶有啟動(dòng)子和熒光素酶基因的質(zhì)粒PGL3共轉(zhuǎn)染到草魚腎(CIK)細(xì)胞，然后分析它們對(duì)CIK細(xì)胞內(nèi)熒光素酶蛋白翻譯抑制的差異。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)空載pcDNA3.1質(zhì)粒的CIK細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)CiPKR-wt、CiPKR-ΔdsRBM2-3、CiPKR-ΔdsRBM1,3、CiPKR-ΔdsRBM1-2、CiPKR-ΔdsRBM3和

6、CiPKR-ΔdsRBM1質(zhì)粒的細(xì)胞熒光素酶蛋白翻譯分別被抑制了78.7％、15%、0、0.5%,、61.8%、67.3%。因此，含有1個(gè)dsRBM的CiPKR突變體對(duì)CIK細(xì)胞合成熒光素酶蛋白的抑制作用極??；含有2個(gè)dsRBM的CiPKR突變體具有較強(qiáng)的抑制作用；而CiPKR-wt則具有最強(qiáng)的抑制作用。同樣，通過(guò)MTT和CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CIK細(xì)胞在分別轉(zhuǎn)染以上各質(zhì)粒后的細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)比，在轉(zhuǎn)染后24h它們的細(xì)胞活力變化很小；

7、在轉(zhuǎn)染后48h，含有單個(gè)dsRBM的CiPKR突變體幾乎不具有抑制細(xì)胞活力的作用；含有2個(gè)dsRBM的CiPKR具有較強(qiáng)的抑制細(xì)胞活力的作用；而CiPKR-wt具有最強(qiáng)的抑制活力作用。進(jìn)一步的細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，轉(zhuǎn)染CiPKR-wt和CiPKR-ΔdsRBM3，CiPKR-ΔdsRBM1重組質(zhì)粒具有較強(qiáng)的降低細(xì)胞數(shù)量的作用。因此，CiPKR的N端串聯(lián)排列2個(gè)dsRBM對(duì)其抑制蛋白翻譯功能是必需的。CiPKR的N端多含有1個(gè)dsRBM1增

8、強(qiáng)了它抑制蛋白合成的功能。
　　為了進(jìn)一步研究CiPKR在抗病毒免疫反應(yīng)中抑制蛋白翻譯作用和細(xì)胞抗病毒免疫細(xì)胞因子合成的關(guān)系。本研究進(jìn)一步克隆了CiPKR抑制蛋白翻譯作用的主要靶蛋白，真核細(xì)胞翻譯起始因子2α(eIF2α)。首次發(fā)現(xiàn)草魚存在2個(gè)eIF2α，分別是CieIF2α(Accession number: KJ126860.1,GI:597914306)和CieIF2α-like(Accession number: KJ12

9、6861.1,GI:597914308)。本研究還克隆了細(xì)胞抗病毒免疫反應(yīng)中，可能存在繞過(guò)CiPKR對(duì)細(xì)胞蛋白合成抑制作用，與抗病毒細(xì)胞免疫因子蛋白翻譯有關(guān)基因CieIF2A(Accession number: KJ126862.1,GI:597914310)。半定量和轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析顯示，在抗草魚出血病毒(GCHV)的抗病毒免疫反應(yīng)中，CieIF2α的轉(zhuǎn)錄表達(dá)在24h內(nèi)降低，而CieIF2A的轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào)。其轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式的差異說(shuō)明兩者在C

10、IK細(xì)胞抗病毒免疫反應(yīng)中的蛋白合成可能起著不同的作用，并且說(shuō)明在CIK細(xì)胞內(nèi)可能存在繞過(guò)一種CiPKR的機(jī)制，即依賴于CieIF2A或CieIF2α-like的蛋白翻譯途徑。
　　對(duì)CiPKR、CieIF2α和CieIF2α-like進(jìn)行了原核表達(dá)，并用以免疫大白兔制備多克隆抗體。通過(guò)ELISA和WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，證明制備的多克隆抗體是有效的。通過(guò)設(shè)計(jì)合成CiPKR特異的siRNA，在GCHV刺激CIK細(xì)胞后對(duì)CiPKR進(jìn)行knock

11、down，然后用Q-PCR和WB的方法分析CIK細(xì)胞CiPKR和CiIFN的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CiPKR特異的siRNA，能有效降低CiPKR的mRNA和蛋白表達(dá)水平，但CiIFN的mRNA和蛋白表達(dá)水平卻發(fā)生了上調(diào)。用PKR的抑制劑2-AP作用于GCHV刺激后的CIK細(xì)胞，CiIFN的轉(zhuǎn)錄表達(dá)也有一定的上調(diào)。說(shuō)明CIK細(xì)胞在CiPKR敲降或CiPKR活性被抑制后，CiIFN的表達(dá)可能經(jīng)由繞過(guò)PKR/NF-κB的表達(dá)途徑。用TLR受體的抑