草魚IRF-2下調(diào)IFN、PKR、PKZ轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制.pdf

1、干擾素調(diào)節(jié)因子(Interferon Regulatory Factor,IRF)是一類參與機(jī)體內(nèi)I型干擾素(IFN)及干擾素刺激基因(ISG)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的調(diào)節(jié)因子。IRF在宿主細(xì)胞抵抗病毒侵入、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和免疫應(yīng)答中都扮演著十分重要的角色。IRF-2是一種多功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控過程中起重要作用?，F(xiàn)有資料表明，IRF-2除了調(diào)控IFN基因、ISG基因轉(zhuǎn)錄外還具有啟動其他細(xì)胞因子、趨化因子轉(zhuǎn)錄的功能。而且，在細(xì)胞免

2、疫反應(yīng)中他們能夠同時(shí)扮演著不同的角色，如IRF-2除了作為干擾素系統(tǒng)基因的負(fù)調(diào)控因子外，還作為正調(diào)控因子激活白細(xì)胞介素-7基因、Ⅱ類轉(zhuǎn)錄活化子基因和Gig2基因的轉(zhuǎn)錄。
　　為了解魚類IRF-2作為負(fù)調(diào)控因子下調(diào)IFN、PKR、PKZ轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制。本文著重對實(shí)驗(yàn)室前期克隆的草魚IRF-2(CiIRF-2)的功能進(jìn)行了分析。系統(tǒng)發(fā)育樹分析CiIRF-2與魚類IRF-2進(jìn)化關(guān)系最為親近，屬于IRF-1亞家族。RT-PCR數(shù)據(jù)分析顯示

3、CiIRF-2在不同的組織中均能夠表達(dá)，但表達(dá)量較低。經(jīng)poly I:C刺激6-12h后，除了腦組織外其他各檢測組織表達(dá)量均明顯上調(diào)。說明CiIRF-2參與了細(xì)胞的抗病毒免疫反應(yīng)。
　　實(shí)驗(yàn)室前期克隆的CiIFN啟動子含有4個(gè)預(yù)測的IRF結(jié)合位點(diǎn)(IRF-E)，分別從-67到-78、-107到-119、-456到-468和-646到-658。CiPKR和CiPKZ啟動子各含有1個(gè)干擾素刺激應(yīng)答元件(ISRE)分別是從-39到-51

4、，-48到-58。為研究CiIRF-2與這些基因的啟動子的親和性，我們構(gòu)建了含有草魚IRF-2的ORF全長和nDBD結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)載體，并通過鎳柱親和層析純化目的蛋白。體外凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)分析表明，原核表達(dá)純化的CiIRF-2與CiIFN，CiPKR，CiPKZ的啟動子均有較強(qiáng)的親和性。隨后，構(gòu)建了不同的啟動子熒光素酶報(bào)告基因載體質(zhì)粒(pGL3-IFN，pGL3-PKR，pGL3-PKZ)和真核表達(dá)載體質(zhì)粒(pcDNA3.1-IRF-1，

5、pcDNA3.1-IRF-2)分別共轉(zhuǎn)染草魚腎細(xì)胞(CIK cell)，然后檢測細(xì)胞熒光活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在CIK中，CiIRF-2能夠抑制CiIFN，CiPKR及CiPKZ的轉(zhuǎn)錄水平。
　　為了進(jìn)一步的了解CiIRF-2抑制CiIFN，CiPKR和CiPKZ轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)理，我們先將pcDNA3.1-IRF-1和pcDNA3.1-IRF-2一起孵育，再與目的基因CiIFN，CiPKR，CiPKZ的啟動子熒光素酶報(bào)告基因載體質(zhì)粒分