Ryanodine對Rapamycin誘導的EOCs功能抑制及其相關eNOS蛋白表達及活性的影響.pdf

1、目的：探討理阿諾堿(Ryanodine)對雷帕霉素(Rapamycin)誘導的內皮生長暈細胞(Endothelialoutgrowthcells，EOCs)功能抑制的影響及其相關內皮型一氧化氮合酶(endothelialNitric-OxideSynthase，eNOS)蛋白表達及活性的影響。
　　 方法：采用密度梯度離心法分離30ml臍血中的單個核細胞(Mononuclearcells，MNC)，接種至事先包被有人纖維連接蛋白

2、的6孔培養(yǎng)板的一孔中(約10cm2)。加入2ml含10％胎牛血清的EGM-2培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后吸除上清及懸浮細胞，貼壁細胞加2ml上述培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此后一周內每24h換1/2原液，一周后每72h換全液并于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。待鋪路石樣細胞生長匯合后傳代，擴增后取第二代細胞采用CD34、Flk-1、Ⅷ因子相關抗原免疫組化及DiI-ac-LDL、FITC-UEA-I雙熒光染色法鑒定培養(yǎng)細胞的內皮屬性。
　　 取第二

3、代EOC分為四組：(1)對照組：加入配制雷帕霉素和理阿諾堿的溶劑(0.3％DMSO)：(2)雷帕霉素干預組：加入10nmol/L雷帕霉素；(3)雷帕霉素和理阿諾堿共同干預組：提前1h加入10μmol/L理阿諾堿，再加入10nmol/L雷帕霉素；(4)理阿諾堿干預組：加入10μmol/L理阿諾堿，各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后觀察結果。
　　 經上述處理后的細胞分別采用CCK8檢測細胞增殖能力、Transwell小室檢測細胞遷移能力、倒

4、置顯微鏡下檢測細胞的粘附能力。用特異性的eNOS抗體及Phospho-eNOS（Thr495）抗體的蛋白免疫印跡法(Westernblot)檢測eNOS的蛋白表達及活性。
　　 結果：采用密度梯度離心法分離人臍血獲得的單個核細胞在培養(yǎng)約第4～6天開始出現梭形細胞，第7～9d形成若干個細胞集落，此后細胞集落逐漸增大至相互匯合，在倒置相差顯微鏡下可見細胞呈現橢圓形鋪路石樣排列，并具有極強的克隆增殖能力。
　　 通過激光掃描共

5、聚焦顯微鏡鑒定，第二代EOCs能夠攝取ac-LDL并結合UEA-I，雙陽性率為100％。免疫組化染色顯示第二代EOCs的Ⅷ因子相關抗原、CD34、Flk-1表達陽性率均為100％。
　　 EOCs與10nmol/L雷帕霉素共孵育24h后細胞的增殖能力、遷移能力、黏附能力均較對照組減弱，分別為0.64±0.04vs0.78±0.03(P＜0.05)，31.73士1.80vs54.20±1.25(P＜0.05)和2.42±0.74v

6、s7.08±1.13(P＜0.05)。10μmol/L理阿諾堿預處理1h能改善雷帕霉素對EOCs的增殖、遷移、黏附能力的抑制作用：雷帕霉素和理阿諾堿共同干預組細胞增殖、遷移、黏附能力與雷帕霉素干預組相比分別為：0.73±0.03vs0.64±0.04(P＜0.05)，41.40±1.25vs31.73±1.80(P＜0.05),4.30+1.49vs2.42士0.74(P＜0.05);10μmol/L理阿諾堿單獨作用對EOCs的增殖、遷

7、移、黏附能力、無顯著影響。理阿諾堿干預組細胞增殖、遷移、黏附能力與對照組相比分別為：0.72±0.06vs0.78±0.03(P＞0.05)，52.13±1.21vs54.20±1.25(P＞0.05),6.03±1.65vs7.08±1.13(P＞0.05)。
　　 通過Werstern-blot對各組細胞總eNOS蛋白表達及eNOS(Thr495)磷酸化水平的檢測，發(fā)現與對照組相比10nmol/L雷帕霉素對總eNOS蛋白表達

8、水平無顯著影響0.51±0.14vs0.73±0.17（P＞0.05），但增強eNOS(Thr495)的磷酸化水平0.76±0.09vs0.50±0.04(P＜0.05);與雷帕霉素組相比，10μmol/L理阿諾堿預處理1h對總eNOS蛋白表達無顯著影響0.52±0.14vs0.51±0.14(P＞0.05)，但降低eNOS(Thr495)的磷酸化水平，0.56±0.13vs0.76±0.09(P＜0.05);與對照組相比，10μmol

9、/L理阿諾堿單獨作用對總eNOS蛋白表達及eNOS(Thr495)磷酸化水平無顯著影響，分別為：0.52±0.16vs0.73±0.17（P＞0.05），0.51±0.11vs0.50±0.04(P＞0.05)。
　　 結論：用貼壁培養(yǎng)法可以在體外成功培養(yǎng)獲得人臍血EOCs。通過熒光細胞化學染色及免疫組化染色可以證實培養(yǎng)細胞具有內皮特性。
　　 雷帕霉素抑制EOCs的增殖、遷移、黏附能力、增強eNOS(Thr495)磷酸