組織工程技術(shù)治療股骨頭骨壞死的探索性研究.pdf

1、研究背景:股骨頭骨壞死是由多種原因引起、病理機制不清的骨科常見難治性疾病，對于股骨頭骨壞死的治療仍存在很多的爭議，目前除晚期骨壞死行全髖關(guān)節(jié)置換外，對早中期骨壞死尚無統(tǒng)一、有效的治愈方法。所以根據(jù)早期及中期股骨頭骨壞死的病理特征，怎樣阻斷早期股骨頭壞死進(jìn)一步發(fā)生塌陷，以及塌陷后骨軟骨損傷或骨軟骨分離后，怎樣重新構(gòu)建功能良好的骨軟骨單元重建關(guān)節(jié)面就顯得十分重要。
　　研究目的:本課題應(yīng)用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)作為藥物載體

2、局部釋放特定濃度的唑來膦酸(ZOL)抑制骨吸收，促進(jìn)骨形成，探索其防止早期股骨頭壞死塌陷的效果。通過將豬關(guān)節(jié)骨軟骨單元用激光制孔并脫細(xì)胞而制備出含有脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)、骨基質(zhì)和完整骨軟骨界面的雙相支架，了解其附和軟骨細(xì)胞后能否有效的促進(jìn)其增值，并通過兔骨軟骨缺損模型驗證其在體內(nèi)對缺損的修復(fù)情況，初步探索其修復(fù)骨軟骨損傷的效果，為組織工程技術(shù)治療中晚期骨壞死骨軟骨損傷及骨軟骨分離提供良好的支架選擇。
　　方法:通過在體外應(yīng)用低濃度的唑來

3、膦酸與成破骨細(xì)胞共培養(yǎng)，應(yīng)用抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)、圖像分析計算骨吸收陷窩面積檢測破骨細(xì)胞形態(tài)及骨吸收情況。堿性磷酸酶染色(ALP)、四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)了解成骨細(xì)胞的形態(tài)及增值情況。選用PLGA作為局部應(yīng)用ZOL的載體，制備含有30μ g的ZOL的PLGA棒。進(jìn)行Micro-CT掃描，分別計算比較各組的骨礦密度(BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BVF)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁間隙(Tb.Sp)掃描后進(jìn)行HE和Ma

4、sson三色染色了解各組間組織學(xué)改變情況。將天然豬骨軟骨單元進(jìn)行激光打孔，化學(xué)脫細(xì)胞的方法獲得三維多孔的脫細(xì)胞骨軟骨基質(zhì)源性支架，并通過組織學(xué)、力學(xué)等測試了解支架的理化性質(zhì);分離培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接種于本支架上了解其對細(xì)胞增殖的影響;將兔軟骨細(xì)胞接種于支架上構(gòu)建細(xì)胞-支架復(fù)合體，移植于兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損，并于12周和24周兩個時間點分次取材，對標(biāo)本進(jìn)行大體觀察、組織學(xué)評價、顯微CT、生物力學(xué)等各方面進(jìn)行評估。
　　結(jié)果:培養(yǎng)1周后

5、破骨細(xì)胞具有典型的形態(tài)特征，并在骨片上形成了吸收陷窩;ZOL組與對照組相比，破骨細(xì)胞數(shù)量及生成吸收陷窩的數(shù)目和面積減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。成骨細(xì)胞有典型的梭形、ALP染色陽性特征，培養(yǎng)至第7天ZOL組成骨細(xì)胞光吸收值(3.37±0.11)高于對照組(2.87±0.12)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與打孔組和PLGA組相比，PLGA-ZOL組中BMD,BVF和Tb.Th顯著增加，而Tb.sp顯著降低，而打孔組和PLGA組并無統(tǒng)計學(xué)差異。而且PLG

6、A-ZOL組股骨頭有更好的形態(tài)，骨小梁保留更完整，新生骨更多。實驗所構(gòu)建的新型骨軟骨支保留了完整的骨、軟骨及骨軟骨界面，可在軟骨層見平行縱向排列的孔隙結(jié)構(gòu)，孔間距300μ m，孔徑形狀呈上寬下窄的錐形結(jié)構(gòu)。壓縮模量是根據(jù)應(yīng)力應(yīng)變曲線所得。結(jié)果顯示:所制備的骨軟骨支架的壓縮模量1.56±0.288MPa與正常的關(guān)節(jié)軟骨的壓縮模量1.983±0.354MPa兩者之間無統(tǒng)計學(xué)的差異。所制備支架的孔隙率為所制備的多孔骨軟骨支架的孔隙率為:59.

7、75±3.73％。通過CCK-8檢測觀察軟骨細(xì)胞在支架上的增殖結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在1，3，5，7天，細(xì)胞在支架上隨著培養(yǎng)時間的增加而增加，同一種細(xì)胞在種植后各時間點之間增殖變化均有統(tǒng)計學(xué)差F=577.7265，P=0.0000。體內(nèi)缺損修復(fù)實驗，組織學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞附和骨軟骨支架的修復(fù)效果顯著優(yōu)于單純支架組和曠置組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，術(shù)后24周，缺損區(qū)修復(fù)的軟骨組織厚度基本正常，特異性染色陽性，軟骨下骨及骨軟骨界面再生完好，與周圍正常組織整合

8、較好;Micro-CT及骨計量學(xué)分析顯示軟骨下骨形成較好;壓痕試驗顯示修復(fù)區(qū)域新生的軟骨組織有較好的力學(xué)特性，與正常軟骨無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論:低濃度(10-6mol/L)的ZOL能夠抑制破骨細(xì)胞的增殖和活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，選擇恰當(dāng)給藥方式和劑量能夠在抑制破骨的同時促進(jìn)成骨。局部使用ZOL能夠抑制局部骨吸收活動，促進(jìn)了局部骨生成，預(yù)防早期股骨頭塌陷，保留更好的髖關(guān)節(jié)功能。通過激光打孔和脫細(xì)胞技術(shù)，以天然關(guān)節(jié)骨軟骨單元為材料