乏氧與Notch1對人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、第一部分乏氧環(huán)境對人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　研究背景:
　　多發(fā)性骨髓瘤(MM)是骨髓內(nèi)漿細(xì)胞克隆性增殖為特征的血液系統(tǒng)惡性腫瘤[1]，研究表明，多種惡性腫瘤由于異常增殖和過度生長會導(dǎo)致瘤體內(nèi)出現(xiàn)乏氧環(huán)境，因此乏氧被認(rèn)為是影響腫瘤生長的重要微環(huán)境因素之一，且為許多實(shí)體瘤的共同特征，其可通過促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄，引起新生血管的形成、糖酵解以及紅細(xì)胞生成增加[2]。同樣骨髓內(nèi)細(xì)胞間的微環(huán)境對MM細(xì)胞的增殖起到至關(guān)重要的

2、作用[3]。有研究檢測到在MM鼠模型以及MM患者骨髓骨髓微環(huán)境處于乏氧狀態(tài)[4,5,6]。但目前乏氧狀態(tài)對骨髓瘤細(xì)胞生長、增殖及凋亡的影響及機(jī)制仍不清楚。
　　相關(guān)文獻(xiàn)表明:惡性腫瘤包含不同范圍的氧分壓，從有良好脈管區(qū)域大約5％O2到壞死部位完全的無氧，平均的氧分壓大約為1％O2，且在許多多發(fā)性骨髓瘤的乏氧研究中，多應(yīng)用1％的氧氣濃度[2]。我們旨在體外模擬MM細(xì)胞生存的骨髓乏氧微環(huán)境，探討乏氧對MM細(xì)胞生長和凋亡的影響及分子機(jī)制

3、，為腫瘤治療新方向提供依據(jù)。
　　研究目的:
　　探討乏氧環(huán)境對人多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞系增殖和凋亡的影響及其分子機(jī)制。
　　研究方法:
　　1、細(xì)胞培養(yǎng):體外培養(yǎng)MM細(xì)胞株RPMI8226細(xì)胞，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞分別放入常氧培養(yǎng)箱及連接Oxycycler C42可編程氧氣控制器乏氧細(xì)胞培養(yǎng)箱，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長條件為常氧環(huán)境(37℃、21％O2、5％CO2)及乏氧環(huán)境(37℃、1％O2、5％CO

4、2)。
　　2、CCK-8方法檢測不同時(shí)間段乏氧對細(xì)胞增殖的影響:將MM細(xì)胞分別置于實(shí)驗(yàn)組（乏氧環(huán)境）及對照組（常氧環(huán)境）細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，分別選擇不同時(shí)間段12h、24h、48h、72h培養(yǎng)的瘤細(xì)胞，應(yīng)用CCK-8方法檢測實(shí)驗(yàn)組、對照組不同環(huán)境培養(yǎng)對RPMI8226細(xì)胞增殖的影響。
　　3、細(xì)胞術(shù)檢測乏氧環(huán)境對MM細(xì)胞周期的影響:乏氧及常氧環(huán)境分別作用于MM細(xì)胞12、24小時(shí)后收集細(xì)胞，PI染色后用流式細(xì)胞儀測定DN

5、A含量并分析細(xì)胞周期變化。
　　4、細(xì)胞術(shù)檢測乏氧環(huán)境對MM細(xì)胞凋亡的影響;乏氧及常氧環(huán)境分別作用于MM細(xì)胞24小時(shí)后收集細(xì)胞，使用AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡變化。
　　5、RT-PCR方法檢測細(xì)胞HIF-1a及增殖相關(guān)基因p21、p27、CyclinD1的mRNA水平變化:乏氧及常氧環(huán)境分別作用于MM細(xì)胞24小時(shí)后收集細(xì)胞，Trizol方法提取細(xì)胞總的RNA，測定濃度后反轉(zhuǎn)為cDNA。RT-P

6、CR方法檢測HIF-1a、p21、p27、CyclinD1的mRNA水平變化。
　　6、Western blot檢測細(xì)胞HIF-1a蛋白表達(dá)變化:常氧及乏氧環(huán)境分別作用于MM細(xì)胞24小時(shí)后收集細(xì)胞，提取蛋白并測定蛋白濃度，蛋白質(zhì)印跡法檢測不同環(huán)境下HIF-1a蛋白表達(dá)的差異。
　　研究結(jié)果:
　　1、乏氧環(huán)境能抑制多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞增殖，乏氧12、24小時(shí)抑制作用明顯，24小時(shí)后隨著時(shí)間的延長，乏氧的抑制

7、作用減弱。
　　2、乏氧環(huán)境能明顯誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，且乏氧環(huán)境較常氧環(huán)境能明顯的促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的凋亡。
　　3、乏氧環(huán)境下，RT-PCR方法檢測相關(guān)基因HIF-1a及p21、p27 mRNA表達(dá)增高，CyclinD1 mRNA表達(dá)降低。
　　4、證實(shí)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中存在HIF-1a蛋白的表達(dá)，并且乏氧環(huán)境中HIF-1a的表達(dá)增加。
　　結(jié)論:
　　通過可編程氧氣控制器乏氧細(xì)

8、胞培養(yǎng)箱模擬多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生理狀態(tài)下的骨髓乏氧微環(huán)境，乏氧環(huán)境較常氧環(huán)境能明顯抑制MM細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯與凋亡，其分子機(jī)制可能與HIF-1a及周期相關(guān)基因p21、p27、CyclinD1表達(dá)改變有關(guān)。
　　第二部分乏氧環(huán)境下siRAN介導(dǎo)的Notch1基因下調(diào)對人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響
　　研究背景:
　　Notch信號通路是細(xì)胞增殖與分化調(diào)控中的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，參與腫瘤的

9、增殖、凋亡及耐藥等過程[7]。哺乳動物Notch受體家族包括Notch1-4，Notch1下游基因包括含有堿性螺-環(huán)-螺旋(bHLH)結(jié)構(gòu)域的HES、HEY家族等。有研究報(bào)道多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中存在Notch1的表達(dá)，γ分泌酶抑制劑(GSI)可抑制MM中蛋白酶體活性與硼替佐米存在協(xié)同抗腫瘤作用，同時(shí)特異性的siRNA對Notch相關(guān)信號分子或某些致癌耐藥基因的靶向抑制，可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖并提高對化療藥物的敏感性[8,9]。靶向siRNA

10、介導(dǎo)Notch1基因?qū)⒖赡艹蔀镸M治療的重要方向。越來越多的證據(jù)表明在不同腫瘤中Notch信號與乏氧通路存在密切聯(lián)系，但乏氧環(huán)境下Notch信號對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增值及凋亡的影響及具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。
　　研究目的:
　　明確多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中Notch1及相關(guān)下游靶基因變化，探討乏氧環(huán)境下Notch1表達(dá)量變化。篩選有效的siRNA下調(diào)Notch1表達(dá)，探討常氧及乏氧環(huán)境下，下調(diào)Notch1表達(dá)對多發(fā)性骨髓瘤PRM

11、I8226細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的靶向治療提供理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.RT-PCR方法檢測乏氧環(huán)境下多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞Notch1及相關(guān)下游靶基因Hes1、Hey1 mRNA水平變化:乏氧及常氧環(huán)境分別作用于MM細(xì)胞24小時(shí)后收集細(xì)胞，Trizol方法提取細(xì)胞總的RNA，測定濃度后反轉(zhuǎn)為cDNA。RT-PCR方法檢測Notch1、Hes1、Hey1 mRNA水平變化。
　　2.Western

12、 blot檢測乏氧環(huán)境下多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞Notch1蛋白表達(dá)變化:常氧及乏氧環(huán)境分別作用于MM細(xì)胞24小時(shí)后收集細(xì)胞，提取蛋白并測定蛋白濃度，蛋白質(zhì)印跡法檢測不同環(huán)境下Notch1蛋白表達(dá)的差異。
　　3.檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞活性及轉(zhuǎn)染效率:取對數(shù)生長期細(xì)胞應(yīng)用X-tremeGENE siRNA轉(zhuǎn)染試劑將熒光CY3陰性siRNA片段轉(zhuǎn)染至多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，分別臺盼藍(lán)染色及熒光顯微鏡顯像。細(xì)胞活性=（總細(xì)胞數(shù)-著色細(xì)胞數(shù)）/

13、總細(xì)胞數(shù)×100％。轉(zhuǎn)染效率=CY3熒光表達(dá)的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100％。
　　4.檢測siRNA片段對Notch1阻斷效率:取對數(shù)生長期細(xì)胞，轉(zhuǎn)染針對Notch1的siRNA片段（濃度分別為:0、30、60、90nM）轉(zhuǎn)染48小時(shí)，RT-PCR檢測siRNA片段對Notch1mRNA表達(dá)的阻斷效率。Western blot檢測Notch1-siRNA在60nm濃度時(shí)，轉(zhuǎn)染48小時(shí)候蛋白水平的阻斷效率。
　　5.CCK-8方

14、法檢測不同環(huán)境下阻斷Notch1后細(xì)胞增殖的影響:取對數(shù)生長期多發(fā)性骨髓瘤PRMI8226細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRAN下調(diào)Notch1的表達(dá)，然后放入常氧及乏氧環(huán)境培養(yǎng)24小時(shí)，CCK-8方法檢測Notch1-siRNA對細(xì)胞增殖的影響。
　　6.WB方法檢測不同環(huán)境下阻斷Notch1后Notch1、p27表達(dá)變化:取對數(shù)生長期多發(fā)性骨髓瘤PRMI8226細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRAN下調(diào)Notch1的表達(dá)，分別置于常氧、乏氧環(huán)境中24小時(shí)，提取蛋白后

15、應(yīng)用WB方法，檢測Notch1、p27蛋白水平表達(dá)變化。
　　7.流式細(xì)胞術(shù)檢測乏氧環(huán)境對MM細(xì)胞凋亡的影響;取對數(shù)生長期多發(fā)性骨髓瘤PRMI8226細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRAN下調(diào)Notch1表達(dá)，分別置于常氧、乏氧環(huán)境中24小時(shí)后收集細(xì)胞，使用AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡變化。
　　研究結(jié)果:
　　1.證實(shí)在多發(fā)性骨髓瘤中存在Notch1 mRNA水平的表達(dá)，且乏氧環(huán)境下水平更升高，其下游靶基因H

16、ey1，Hes1的mRNA表達(dá)也增高。同時(shí)，在多發(fā)性骨髓瘤中存在Notch1蛋白水平的表達(dá)，且乏氧環(huán)境下蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。
　　2.針對Notch1的siRNA片段可有效下調(diào)Notch1的表達(dá)，siRAN轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，干擾組mRNA的表達(dá)較對照組下調(diào)82％。干擾組Notch1蛋白明顯下調(diào)80.1％。
　　3.無論常氧、乏氧環(huán)境siRNA下調(diào)Notch1表達(dá)后，Notch1-siRNA轉(zhuǎn)染組較非轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖減低，且乏氧轉(zhuǎn)染

17、組較其余三組細(xì)胞增殖降低最顯著。
　　4.凋亡蛋白p27在乏氧下較常氧下表達(dá)增高，在常氧及乏氧環(huán)境下Notch1-siRNA轉(zhuǎn)染組較非轉(zhuǎn)染組細(xì)胞p27的表達(dá)增高，乏氧轉(zhuǎn)染組細(xì)胞p27的表達(dá)最高。
　　5.在常氧及乏氧環(huán)境下，轉(zhuǎn)染組較非轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡都明顯增加，且乏氧轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡率最高。
　　結(jié)論:
　　證實(shí)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞存在Notch1基因及下游靶基因的表達(dá)，且乏氧環(huán)境下Notch1基因表達(dá)明顯增高。篩選有