細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標記法鑒定食管鱗癌蛋白差異表達譜.pdf

1、背景：
　　 食管癌（Esophageal cancer，EC）是世界上六大常見的惡性腫瘤之一。食管癌的發(fā)病具有明顯的地區(qū)差異，河南太行山區(qū)的林州市及其毗鄰的輝縣、安陽等地區(qū)是世界及我國EC發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)之一，目前仍是該地區(qū)腫瘤相關死亡的主要原因之一。
　　 目前，對食管原位癌和粘膜內癌的早期食管癌患者，內鏡下粘膜內切除術后五年生存率可分別達到100％和95％；早期食管癌經外科切除后，5年和10年生存率分別為9

2、0％和75％[1]。然而，大多數(shù)病人在臨床上確診之后的生存時間不超過一年，死亡率非常高，五年生存率僅為8％，60-70％的病例死于全身播散和轉移，主要是由于就診病人幾乎全部是中晚期患者。提高食管癌治療效果的關鍵在于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療，然而目前尚無早期診斷和預警的有效措施。因此，闡明食管癌的發(fā)病因素及多階段演進分子機制，篩選和鑒定與食管癌變密切相關的預警分子，找尋新的治療靶點和更有效的治療方法，確定高危人群監(jiān)測和食管癌早期診斷的

3、高特異性、高敏感性生物標志物，具有十分重要的理論意義和臨床應用價值。
　　 定量蛋白質組學是后基因組時代研究熱點之一[2]，不但成為疾病診斷、預后標志物及治療靶點的探索、鑒定的重要工具，更增進了對生命過程及疾病發(fā)生分子機制的認識與理解。二維電泳和穩(wěn)定同位素標記蛋白或肽段是定量蛋白質組學常用的兩種技術手段。我們前期研究應用二維電泳（Two-dimensional electrophoresis,2-DE）對食管上皮永生化細胞和癌細

4、胞、及河南食管癌高發(fā)區(qū)林州市的食管癌及癌旁組織進行研究，已發(fā)現(xiàn)三十多種與食管癌發(fā)生發(fā)展相關的蛋白。然而,2-DE 本身還存在著技術缺陷，如對分子量過大或過小、酸性或堿性、難溶的蛋白質檢出敏感性較低，并且低通量、耗時長、難以精確定量和自動化等。
　　 目前穩(wěn)定同位素標記結合質譜定量分析方法發(fā)展迅速。細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標記（Cell culture and stable isotope labeling，SILAC）是在細胞培養(yǎng)過程

5、中利用穩(wěn)定同位素標記氨基酸結合質譜技術對蛋白表達進行定量分析的一種新技術，SILAC 不僅可以對蛋白質進行定性分析，還可精確定量，具有樣本需求量少、操作簡單、直接、高效等特點[3]。
　　 因此，穩(wěn)定同位素標記結合質譜定量分析正在逐步取代2-DE[4]。本研究采用SILAC 技術分別培養(yǎng)標記食管上皮永生化細胞（重型穩(wěn)定同位素[U-13C6]-H-Lysine和[U-13C6]-H-Arginine）和食管癌細胞（輕型穩(wěn)定同位素[

6、12C6]-L-Lysine和[12C6]-L-Arginine），待細胞標記完全后，細胞裂解提取蛋白，分別從各食管永生化細胞（NE3、NE6和NEC）和食管癌細胞（EC1、EC109和EC9706）取等量總蛋白，制備食管永生化細胞和癌細胞的混合蛋白樣本，經SDS－PAGE分離，根據(jù)膠中蛋白含量將膠分為48 份，膠內胰酶消化并洗脫酶解肽混合物，高效液相-電噴霧串聯(lián)質譜（Highperformance liquid chromatogra

7、phy-electrosprayI onization-mass sepectrometry,HPLC-ESI-MS/MS）定量分析永生化細胞和癌細胞蛋白差異表達譜，確定與食管癌形成、發(fā)生發(fā)展相關的關鍵差異表達蛋白質分子。
　　 目的：
　　 本研究通過采用SILAC和HPLC-ESI-MS/MS定量分析確立與食管癌變相關的差異蛋白表達譜，篩選候選關鍵蛋白質分子，探討其生物學意義，豐富食管癌變的分子理論，為食管癌高危人群

8、篩查、早期診斷、治療監(jiān)測提供更多的候選分子，旨在達到降低食管癌發(fā)病率和死亡率，改善預后。
　　 方法：
　　 1.食管上皮永生化細胞NE3、NEC、NE6 培養(yǎng)條件由角質形成細胞無血清培養(yǎng)基（Keratinocyte serum free medium，KSFM）培養(yǎng)逐步適應RPMI1640 培養(yǎng)條件；
　　 2.分別利用包含重型穩(wěn)定同位素[U-13C6]-H-Lysine和[U-13C6]-H-Arginine

9、和輕型穩(wěn)定同位素[12C6]-L-Lysine和[12C6]-L-Arginine的培養(yǎng)基SILAC-RPMI1640 雙重培養(yǎng)標記永生化細胞NEC、NE3、NE6和食管癌細胞EC1、EC109、EC9706；
　　 3.混合蛋白制備及SDS-PAGE分離，膠內胰酶消化蛋白為肽段，HPLC-ESI-MS/MS 檢測定量分析，蛋白質數(shù)據(jù)庫查詢、生物信息學等方法確定差異表達的蛋白質分子名稱；
　　 4.候選關鍵差異蛋白質分子

10、判定標準：差異倍數(shù)大于1.5，HPLC-ESI-MS/MS 鑒定到2個以上特異肽段，并且變異系數(shù)小于50％；
　　 5.免疫印跡方法（Western blot，WB）驗證關鍵候選蛋白分子MIF 在食管永生化細胞和癌細胞系及分泌上清中的表達變化；
　　 6.免疫組織化學方法（Immunohistochemistry，IHC）確立MIF 在活檢的食管正常粘膜及癌前病變粘膜和手術標本的各臨床分期食管癌組織中的變化特征；7.酶聯(lián)

11、免疫吸附實驗（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測MIF 在食管癌患者血清和非癌對照病人中的表達特征。
　　 結果：
　　 1.通過SILAC 標記、質譜、生物信息學等方法，在食管永生化及癌細胞中共鑒定到1790種蛋白。其中差異倍數(shù)1.5倍以上，HPLC-ESI-MS/MS 鑒定到2個以上特異肽段，變異系數(shù)小于50％的差異蛋白分子共有43個；這些蛋白參與細胞生長代謝的多個生

12、物學過程，分屬多個家族：如骨架蛋白、蛋白抑制劑家族成員、氧化還原類蛋白、分子伴侶、細胞因子、參與信號轉導、脂代謝、能量代謝及酶代謝相關的蛋白等；
　　 2.Western blot 驗證了MIF 在食管癌組織、癌細胞系中的高表達；
　　 3.IHC 確定了MIF 在食管癌前病變和中晚期食管癌組織中表達顯著增高（p<0.05）；
　　 4.ELISA分析結果表明，食管癌患者血清中MIF表達升高，并且食管癌晚期患者血

13、清中MIF表達進一步升高（p=0.076）。
　　 結論：
　　 1.SILAC 標記培養(yǎng)細胞聯(lián)用HPLC-ESI-MS/MS 可定量比較分析、鑒定與疾病發(fā)生發(fā)展相關的差異蛋白表達譜；
　　 2.本研究共鑒定出與食管癌變相關的關鍵候選差異蛋白分子共43種；
　　 3.MIF 可能是食管癌變多階段演進過程中的重要變化分子之一，提示MIF 一方面可能是食管癌高危人群篩查、早期診斷及療效評估的候選分子標志物，另