二維電泳和質譜技術鑒定食管鱗癌N-連接糖蛋白差異表達譜.pdf

1、背景:EC(Esophageal Cancer, EC)是世界上八大常見的惡性腫瘤之一。在中國,EC的主要組織學類型為食管鱗狀細胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC),約占所有EC的90％。河南太行山區(qū)的林州市及其毗鄰的輝縣、安陽等地區(qū)是世界及我國EC發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)之一,目前仍是該地區(qū)腫瘤相關死亡的主要原因之一。EC的重要特征之一是高死亡率,大多數(shù)病人在臨床上確診之后的生存時間

2、不超過一年,其五年生存率僅為8%。提高EC治療效果的關鍵在于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療,食管原位癌和粘膜內癌患者的術后五年生存率可分別達到100%和95%。然而,目前尚無早期診斷和預警的有效措施。因此,闡明ESCC的發(fā)病因素及多階段演進分子機制,篩選和鑒定與癌變密切相關的預警分子,找尋新的治療靶點和更有效治療方法,對建立高危人群監(jiān)測和ESCC早期診斷的生物標志物和方法,從而降低其發(fā)病率和死亡率,具有十分重要的理論意義和臨床應用價值。<

3、br>　　定量蛋白質組學是后基因組時代研究熱點之一,是疾病診斷的分子標志物篩選和治療靶點鑒定的重要工具。二維電泳和穩(wěn)定同位素標記蛋白或肽段是定量蛋白質組學常用的兩種技術。然而,由于蛋白質組分極其復雜,不但包括同一基因的不同轉錄體、轉錄后不同的剪切體,還涉及翻譯后的修飾過程。到目前為止,沒有任何單一技術能夠徹底全面的分析任意物種的全部蛋白質組組分,而且高豐度蛋白通常掩蓋了具有重要生理、病理功能的低豐度蛋白。亞蛋白質組學能夠有效降低蛋白質組

4、的復雜性,是挖掘低豐度蛋白生物標志物常用策略之一,如細胞膜、線粒體、細胞核等亞蛋白質組、各功能復合體蛋白質組、特異物理化學結構的蛋白質組等。
　　哺乳動物中,蛋白質糖基化修飾是最為常見的一種翻譯后修飾,糖蛋白約占所有蛋白的50%。糖蛋白的寡糖側鏈不但具有重要的生理功能,如蛋白質分子細胞內定位、蛋白穩(wěn)定性、酶活性、粘附性、蛋白質分子間及細胞間相互作用、識別等功能;而且亦參與許多病理過程,如蛋白質的異常糖基化是腫瘤形成與進展過程中的一

5、個基本特性,與癌細胞的侵襲、轉移過程密切相關。糖蛋白的功能日益顯著和重要,詳盡闡明糖蛋白質組組分及功能有助于增進理解認識生理、病理過程。
　　根據(jù)寡糖側鏈共價結合的氨基酸殘基不同,可將糖蛋白分為N-連接糖蛋白(與天冬酰胺殘基酰胺氮相連)和O-連接糖蛋白(與絲氨酸、蘇氨酸或羥賴氨酸殘基的羥基共價結合)。N-糖基化位點是N-X-S/T組成的三聯(lián)序列子區(qū)域,其中的X可為脯氨酸以外的任意氨基酸。N-寡聚糖側鏈的變異發(fā)生于多種腫瘤,包括寡聚

6、糖核心結構及末端殘基結構的變化;該變異同時也導致同一蛋白形成不同糖蛋白異構體,在二維凝膠電泳圖譜上表現(xiàn)為多個不同等電點或分子量相近的蛋白質點。寡聚糖作為蛋白質分子翻譯后修飾的主要成分之一,大大增加了蛋白質分子的功能多樣性。在細胞外的微環(huán)境中,N-連接糖蛋白存在相當普遍,如胞膜蛋白的胞外區(qū)域、分泌蛋白及血清、唾液、腦脊液等體液內。上述證據(jù)表明糖蛋白變化反映了許多疾病的病理過程,具有重要的臨床應用價值,故而許多現(xiàn)在臨床應用的診斷標志物或治療

7、靶點多為糖蛋白,如CA125(卵巢癌)、PSA(前列腺癌)、c-erbB-2(乳腺癌)、AFP-L3和GP73(肝癌)等?？梢灶A見,系統(tǒng)、定量分析糖蛋白的變化,不但有利于新的疾病診斷標志物、治療靶點及治療效果的評價與監(jiān)測手段的探尋,還有助于進一步理解疾病發(fā)生發(fā)展的規(guī)律及治療的分子機制。
　　方法：采用植物凝集素串聯(lián)法提取ESCC與癌旁切緣形態(tài)學正常食管黏膜組織中的N-連接糖蛋白,二維電泳和質譜等分析、鑒定與ESCC發(fā)生展密切相關的

8、差異表達的糖蛋白質分子,為ESCC的早期診斷和高危人群普查提供更多的候選分子,并為深入理解ESCC發(fā)病的分子機制奠定重要理論基礎。
　　1、根據(jù)標本庫中ESCC患者的臨床資料,如年齡、性別、病理分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期等,選取適宜手術標本,NP-40裂解液提取各例ESCC及癌旁組織蛋白,Bradford法測定蛋白濃度,從各例ESCC標本及癌旁組織蛋白提取物中,分別取等量蛋白制備混合樣本。
　　2、植物凝集素

9、親合層析柱的制備:寡甘露糖型親合層析柱,分別加入500ul的瓊脂糖偶聯(lián)刀豆凝集素(Concanavalin A, ConA)、晶狀體凝集素(Lentil lectin, LCH)、雪花凝集素(Sonwdrop lectin, GNA)于Poly-Prep層析柱內;唾液酸型蛋白層析柱,分別加入等量的瓊脂糖偶聯(lián)的麥胚凝集素(Wheat germ agglutinin, WGA)、接骨木凝集素(Elderberry lectin, SNA)于

10、Poly-Prep層析柱內;然后用含有0.01%Triton X-100的糖蛋白結合緩沖液洗滌1次,再用糖蛋白結合緩沖液洗滌2次以備用。
　　3、N-連接糖蛋白序列性抽提:用N-連接糖蛋白結合緩沖液將6000ug的混合蛋白標本稀釋至1ml,加入寡甘露糖蛋白親合層析柱,室溫孵育2h,500rpm收集流出液,結合緩沖液洗滌4次,各10min,用200mM的甲基-α-D甘露糖苷洗脫富含寡甘露糖的N-連接糖蛋白;混合上述的流出液及洗滌液,

11、加入唾液酸蛋白層析柱,如上洗滌后用200mM的N-乙酰葡糖胺洗脫富含唾液酸的N-連接糖蛋白。
　　4、二維電泳及質譜技術鑒定差異表達的糖蛋白質分子:將上述洗脫液中加入-20℃丙酮使終濃度至80%,-20℃過夜,15,000g離心30min,棄上清,室溫干燥20min,加入100ul的2D裂解液溶解沉淀蛋白。Bradford法測定蛋白濃度,取50μg的蛋白,加入2D裂解液至250ul,用13cm pH3-10 NL IPG膠條進行一

12、維等電聚焦電泳;等電聚焦后分別用含1%DTT和2.5%IAA平衡液孵育15min,然后進行第二維的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,銀染、掃描、圖像分析、統(tǒng)計學分析,確定具有顯著統(tǒng)計學意義的差異蛋白點。制備質譜分析的2D膠,蛋白的上樣量增加至1000ug,如上法進行等電聚焦、二維電泳、考馬斯亮藍染色,切取差異表達的蛋白質點、膠內胰酶消化、MALDI-TOF-TOF檢測、數(shù)據(jù)庫檢索確定差異蛋白點的名稱。
　　5、關鍵候選糖蛋白質分

13、子差異表達的驗證:應用Western blot,驗證關鍵候選蛋白質分子或具有異常N-連接糖基化的蛋白質異構化在ESCC中的差異表達。
　　結果:
　　1、鑒定出36個ESCC相關的差異表達的寡甘露糖型糖蛋白,包括20個高表達寡甘露糖型糖蛋白和16個低表達寡甘露糖型糖蛋白;
　　2、鑒定出39個與ESCC相關的差異表達的唾液酸型糖蛋白,包括10個高表達唾液酸型糖蛋白和29個低表達糖蛋白;
　　3、Westen bl