串聯(lián)18O同位素標(biāo)記應(yīng)用于定量糖蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、近年來,隨著蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)的快速發(fā)展,蛋白質(zhì)的翻譯后修飾引起了越來越多的關(guān)注,特別是蛋白質(zhì)糖基化修飾。蛋白質(zhì)的糖基化修飾是最常見、最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一,在許多重要的生理和病理過程中起著重要的作用。隨著糖蛋白/糖肽富集技術(shù)和生物質(zhì)譜技術(shù)等的發(fā)展,大規(guī)模N-型糖蛋白的糖基化位點(diǎn)鑒定得以實(shí)現(xiàn)。但關(guān)于N-糖基化位點(diǎn)的糖基化程度定量,及糖基化程度變化和蛋白表達(dá)水平變化的關(guān)系研究的很少?；诖?本論文發(fā)展了一種串聯(lián)18O

2、穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法(Tandem18O Stable Isotope Labeling,TOSIL),用于對N.糖基化位點(diǎn)的糖基化程度進(jìn)行相對定量,并比較糖基化程度變化和蛋白表達(dá)水平變化的關(guān)系。
　　 本論文由四部分組成。
　　 第一章緒論首先介紹了蛋白質(zhì)糖基化修飾研究現(xiàn)狀,尤其對糖蛋白/糖肽及糖基化程度定量方面的研究進(jìn)展做了綜述；概述了卵巢癌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展,說明了本論文選題目的和意義。
　　 第二章所述工

3、作用兩種標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白發(fā)展了串聯(lián)18O穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法(TOSIL),用于對N-糖基化位點(diǎn)的糖基化程度進(jìn)行定量。概括來說,兩組對照的樣品分別在H216O或H218O水中進(jìn)行胰蛋白酶酶解和PNGase F釋放糖鏈,兩步酶解都在H218O水中處理的糖肽(僅含一個糖基化位點(diǎn))會被標(biāo)記上三個18O原子:兩個位于肽段的C末端,一個標(biāo)記在糖基化位點(diǎn)上。分別用16O或18O標(biāo)記的糖肽對峰產(chǎn)生6 Da的差異,而非糖肽僅在C末端標(biāo)記氧原子,產(chǎn)生4 Da的差

4、異,由此可以明顯的區(qū)分糖肽和非糖肽,并同時(shí)對糖基化水平和蛋白水平進(jìn)行定量。用16O或18O標(biāo)記的兩組樣品混合后用Nano-LC-ESI-MS/MS進(jìn)行分析,利用PMF圖譜中對峰的強(qiáng)度進(jìn)行相對定量。對該方法重復(fù)性和準(zhǔn)確性的考查結(jié)果顯示,在10倍動態(tài)范圍內(nèi)該方法有很好的線性關(guān)系(r2>0.99)和重復(fù)性(SD在0.06到0.21之間)。TOSIL方法分析過程簡單,易操作,引入了3個18O原子,減少了質(zhì)譜峰的重疊,從而使得得到的定量信息足夠準(zhǔn)

5、確。
　　 第三章工作是將TOSIL方法用于實(shí)際樣品的分析。對卵巢癌血清樣品和正常人血清樣品中的N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行了糖基化程度的相對定量分析,總共得到了49個糖蛋白中86個糖基化位點(diǎn)的定量信息。并對比分析了糖基化程度的變化和對應(yīng)的蛋白水平的變化,從中發(fā)現(xiàn)了一些有特殊變化的糖基化位點(diǎn)。此外,還用Western-blot對蛋白水平的變化進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果顯示與TOSIL方法得出的結(jié)論一致。說明此方法可以大規(guī)模用于實(shí)際樣品的分析,得到的