細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標記定量分析食管癌順鉑耐藥相關蛋白.pdf

1、背景:
　　多藥抗藥性(Multidrug-resistance,MDR)是指惡性腫瘤病人或細胞接觸某種抗癌藥物后,繼而對該藥物及其他抗癌藥產(chǎn)生耐藥性,是腫瘤患者或細胞避免抗癌藥物毒性作用效應的總稱。MDR使腫瘤患者對化療藥物甚至一系列廣譜藥物的敏感性降低,最終導致腫瘤患者化療療效的降低甚至無效。許多學者進行了MDR的相關研究,主要目的是為了研究MDR的分子機制,為MDR逆轉(zhuǎn)提供分子靶點及奠定理論基礎,最終治愈腫瘤患者。MDR的發(fā)

2、生涉及到細胞膜、細胞質(zhì)、細胞間隙以及細胞核的結構或者功能的改變。概括起來,腫瘤細胞的耐藥機制主要包括以下幾個方面,(Ⅰ)細胞吞噬作用的改變,(Ⅱ)細胞膜磷脂類的改變及相互作用,(Ⅲ)細胞膜轉(zhuǎn)運通路的表達和活化,(Ⅳ)增強的藥物結合力和胞內(nèi)積聚,(Ⅴ)胞吐作用的改變,(Ⅵ)MDR相關蛋白的表達和活化,(Ⅶ)離子微環(huán)境的改變,如pH、Ca2+濃度等。
　　蛋白質(zhì)組學是后基因組時代的一個研究熱點,尤其是定量蛋白質(zhì)組學,不僅是診斷疾病、治

3、療靶點的探索及鑒定的重要工具,更進一步加深了對疾病發(fā)生的分子機制的認識與理解。二維電泳和穩(wěn)定同位素標記是定量蛋白質(zhì)組學常用的兩種基本技術手段。我們前期研究應用二維電泳(Two-dimensional-electrophoresis,2-DE)對食管癌及癌旁組織進行研究,已發(fā)現(xiàn)三十多種與食管癌發(fā)生發(fā)展相關的蛋白。但是,2-DE本身存在著許多技術缺陷和不足,如對偏堿性或偏酸性、分子量過小或過大、難溶的蛋白質(zhì)的檢出敏感性較低,并且消耗時間長、

4、低通量、難以精確自動化和定量等。細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標記( Stable isotope labeling with amino acids in cell culture, SILAC)技術是在細胞培養(yǎng)過程中用穩(wěn)定同位素標記氨基酸結合質(zhì)譜技術對蛋白質(zhì)表達進行定量分析的一種技術,SILAC不但實現(xiàn)了對蛋白質(zhì)進行定性分析,而且還可以進行精確定量分析,具有樣本需求量少、直接、高效、操作簡單等特點。所以,穩(wěn)定同位素標記結合質(zhì)譜定量分析技術正在逐

5、步取代2-DE技術。
　　食管癌(Esophageal-carcinoma,EC)是世界上常見的惡性腫瘤之一,其流行病學特征是具有顯著的地域性,高發(fā)區(qū)與低發(fā)區(qū)德發(fā)病率相差高達500倍,食管癌的預后極差,中晚期患者的5年生存率僅為10％左右。河南省林州市是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一。過去幾十年里,許多學者此地區(qū)進行了各方面的研究及綜合研究,提出食管癌是一個多因素多階段的復雜過程,目前該地區(qū)人群食管癌的發(fā)病率和死亡率一直未得到明顯改善,

6、仍然是該地區(qū)腫瘤患者的主要死亡原因之一。順鉑(Cis-diamminedichloroplati num,CDDP)和5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil-5-FU)標準化療方案是目前EC綜合治療的重要手段,但是,治療效果很不理想,主要原因是由于腫瘤細胞獲得了多藥耐藥性(Multidrug-resistance,MDR),由于耐藥性導致了腫瘤化療的最終失敗。因此,鑒定M DR耐藥相關蛋白具有重要的理論和實際意義,不僅有助于化療方案

7、的制定,還能夠幫助進一步理解MDR發(fā)生的分子機制。
　　目的:
　　本研究采用SILAC和高效液相-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(High-performance-liquid chromatography-electrosprayionization-mass-spectrometry,HPLC-ESI-MS/MS)技術,定量分析并鑒定食管癌順鉑耐藥相關蛋白,分析研究食管癌順鉑耐藥發(fā)生的分子機制,豐富和深入理解MDR發(fā)生的分子機制,為M

8、DR逆轉(zhuǎn)的新型藥物設計提供有價值的分子靶點。
　　方法:
　　1、濃度遞增法建立食管癌CDDP耐藥細胞系EC9706/CDDP;
　　2、SILAC和HPLC-ESI-MS/MS技術定量分析并鑒定EC9706/CDDP與CDDP敏感的母細胞系EC9706的差異表達蛋白;
　　3、免疫印跡方法(Western blotting, WB)驗證食管癌順鉑耐藥相關蛋白。
　　結果:
　　EC9706/CDDP

9、細胞呈貼壁性生長,增殖緩慢,多形性、異形性明顯,耐藥指數(shù)是3.23。74種差異表達的蛋白質(zhì)包括能量代謝相關蛋白(11%)、細胞骨架蛋白(20%)、蛋白合成及參與mRNA處理類蛋白(12%)、DNA修復及轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白(11%)、氧化還原維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)穩(wěn)定蛋白(9.5%)、分子伴侶蛋白(8.1%)、核組裝相關蛋白(2.7%)、免疫/炎癥反應相關蛋白(5.4%)、細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運功能相關蛋白(5.4%)、核糖體結構類蛋白(8.1%)等。
　　小結