潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道硫酸鹽還原菌的檢測(cè).pdf

1、腸道微生物是棲息在人和動(dòng)物腸道內(nèi)的微生物的統(tǒng)稱,其組成是宿主特異性的,并在宿主生命過程中不斷進(jìn)化。共生在人腸道內(nèi)微生物的基因組,大約是人類自身基因組的150倍左右,因此也被稱為“人類第二基因組”。宿主腸道內(nèi)的微生物(gut microbiota)能利用宿主體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行代謝,并參與人體的免疫調(diào)節(jié)過程,進(jìn)而影響著宿主的生理狀態(tài),同時(shí),宿主的生理狀態(tài)發(fā)生變化也會(huì)導(dǎo)致人體腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,二者之間相互影響,在生命過程中不斷進(jìn)行代謝的

2、交換或共代謝過程。
　　硫酸鹽還原菌(Sulphate-reducing Bacteria, SRB)廣泛存在于人和動(dòng)物腸道內(nèi),作為腸道菌群的成員之一,已被報(bào)道與潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸癌和以肥胖、胰島素抵抗為代表的代謝綜合征的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。SRB是以硫酸鹽作為呼吸鏈終端電子受體、以有機(jī)化合物(如氨基酸、糖類等)或無機(jī)化合物(H2等)為電子供體而產(chǎn)生H2S的嚴(yán)格厭氧微生物。腸道硫酸鹽還原菌一方面因?yàn)楫a(chǎn)生的H2S能抑制丁酸鹽的氧化從而具有

3、細(xì)胞毒性和遺傳毒性,另一方面,作為革蘭氏陰性菌,可能通過產(chǎn)生脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS),從而具有誘發(fā)炎癥的能力。由于具有這些特征,SRB是人和動(dòng)物腸道內(nèi)的重要的功能菌。因此,從數(shù)量、組成、生理特性等多個(gè)不同角度研究分析腸道硫酸鹽還原菌,可以更好地理解其與潰瘍性結(jié)腸炎、肥胖等多種疾病之間的關(guān)系。
　　本研究重點(diǎn)解析潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC)患者治療前后腸道中SRB的變化規(guī)

4、律。我們與南京市中醫(yī)院全國(guó)肛腸病醫(yī)療中心合作,招募40名UC患者,采用潰結(jié)灌腸液進(jìn)行治療2周后,患者病癥得到治療或緩解,其C反應(yīng)蛋白濃度恢復(fù)到正常水平(<5mg/L),白細(xì)胞數(shù)也有所下降。在提取了UC患者糞便微生物基因組DNA后,我們首先采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)和變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)的方法,

5、利用SRB的分子標(biāo)記物腺苷酰硫酸鹽(Aps)還原酶基因?qū)冃越Y(jié)腸炎患者以及健康人腸道內(nèi)的SRB的數(shù)量進(jìn)行定量檢測(cè)并對(duì)多樣性進(jìn)行分析,以驗(yàn)證SRB與UC之間的相關(guān)性并同時(shí)了解DGGE指紋圖譜的分布情況。40個(gè)UC患者治療前后以及21個(gè)健康人的定量結(jié)果顯示,治療前的患者腸道內(nèi)SRB的數(shù)量顯著高于治療后和健康人腸道內(nèi)SRB的數(shù)量(P<0.05);UC患者治療后腸道內(nèi)SRB的數(shù)量與健康人相比,在同一水平上,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。DGGE指紋圖譜的結(jié)

6、果表明,健康人腸道中SRB組成較簡(jiǎn)單,大多僅有一條DGGE條帶。 UC患者條帶的整體分布與健康人區(qū)別較大,較多樣本存在共有一條條帶,其序列與一株Desulfovibrio piger菌株的APS還原酶基因有86％同源性,顯示該菌在UC患者腸道中有較高檢出幾率。對(duì)健康人樣本所有條帶以及UC樣本中共有條帶進(jìn)行割膠測(cè)序,在線比對(duì)后結(jié)果顯示,它們的最近鄰居均為Desulfovibrio desulfuricans和Desulfovibrio p

7、iger的APS還原酶基因。
　　如要進(jìn)一步明確SRB是否參與UC的發(fā)生發(fā)展,最有效的方法是將SRB菌株接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,觀察動(dòng)物腸道中SRB大量增多后是否會(huì)發(fā)展出相應(yīng)的臨床癥狀或表型。本研究接下來進(jìn)行了兩部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備工作。
　　首先,在SRB的培養(yǎng)過程中,我們發(fā)現(xiàn)SRB在厭氧的Postgate培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢,細(xì)菌數(shù)量低,很難保證動(dòng)物接種實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞數(shù)量。我們針對(duì)已經(jīng)分離、純化的腸道硫酸鹽還原菌,建立了一種能快速、高效

8、地培養(yǎng)菌體的培養(yǎng)基。通過比較營(yíng)養(yǎng)豐富的GAM肉湯與常用于培養(yǎng)硫酸鹽還原菌的選擇性培養(yǎng)基Postgate的培養(yǎng)效果,摸索在GAM肉湯中添加不同濃度的硫酸鹽對(duì)兩種腸道硫酸鹽還原菌-Desulfovibrio desulfuricans和Desulfovibrio intestinalis的培養(yǎng)效果。最終確定效果最佳的事宜SRB生長(zhǎng)的改良 GAM培養(yǎng)基配方,并測(cè)定在該培養(yǎng)基中 D. desulfuricans的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示與Postga

9、te培養(yǎng)基相比,GAM肉湯能在2天內(nèi)快速培養(yǎng) D. desulfuricans,但培養(yǎng)至6天時(shí)細(xì)菌數(shù)量大幅降低。在GAM肉湯中添加 Na2SO4與FeSO4,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),均顯著地促進(jìn)硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)。在此基礎(chǔ)上改良 GAM肉湯培養(yǎng)基,培養(yǎng)得到的細(xì)菌數(shù)量較 GAM肉湯顯著提高。D.desulfuricans的生長(zhǎng)曲線顯示,2天時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)達(dá)到最高峰,數(shù)量可達(dá)3.5×107CFU/ml;培養(yǎng)6天,細(xì)菌數(shù)量為7.3×106 CFU/ml

10、。這些都表明改進(jìn)的GAM培養(yǎng)基,能快速、高效地培養(yǎng)SRB。
　　其次,我們進(jìn)行了將一株已分離并具有利福平抗性的SRB菌株-D.desulfuricans回接小鼠的預(yù)實(shí)驗(yàn),以判斷接種SRB菌株是否會(huì)引起動(dòng)物的急性致死以及該菌株是否可在小鼠體內(nèi)定植。將分離的D.desulfuricans利用改進(jìn)的GAM培養(yǎng)基,大量培養(yǎng)后,通過尾靜脈注射實(shí)驗(yàn),每籠隨機(jī)分配2-3只ICR小鼠,分別觀察低劑量(102 CFU)和高劑量(108 CFU)是否

11、出現(xiàn)急性致病性,隨后,在保證每籠小鼠體重比較均勻的前提下將16只ICR小鼠隨機(jī)分成4組,通過灌胃的方式(108CFU,分一次灌胃和連續(xù)灌胃),和Postgate平板計(jì)數(shù)的方式分析分離的D.desulfuricans的定植情況以及小鼠的生長(zhǎng)和進(jìn)食量的情況。結(jié)果顯示D.desulfuricans在注射劑量下無急性致病性,定植能力較弱。
　　綜上所述,本研究通過SRB功能基因的定量PCR和DGGE方法,分析了40名UC患者在治療前后以及