雞新城疫病毒HN09-69株主要基因的克隆、原核表達(dá)及鑒定.pdf

1、新城疫(Newcastledisease.ND)是由新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)引起禽的高度接觸性傳染病，主要引起呼吸道，神經(jīng)系統(tǒng)或腸道病變。NDV是單股負(fù)鏈的RNA病毒，為副黏病毒科副黏病毒亞科禽腮腺炎病毒屬中的一個(gè)成員，基因組編碼NP、P、M、F、HN、L6種主要結(jié)構(gòu)蛋白。另外，P基因可以通過(guò)“RNA編輯”方式編碼產(chǎn)生額外的兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白-V蛋白和W蛋白。從1926年發(fā)現(xiàn)該病以來(lái)，NDV傳播到世界

2、各個(gè)國(guó)家和地區(qū)，并對(duì)世界養(yǎng)禽業(yè)及國(guó)際貿(mào)易造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2009年本實(shí)驗(yàn)室從中牟某發(fā)病雞場(chǎng)采集病料，并經(jīng)病毒分離、鑒定和致病性實(shí)驗(yàn)，證明病原為強(qiáng)毒NDV，并命名為HN09-69株。本試驗(yàn)以HN09-69分離株為研究對(duì)象，對(duì)主要基因分別進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)及鑒定。運(yùn)用RT-PCR技術(shù)從HN09-69分離株的基因組中分別擴(kuò)增出NP、P、M、F、HN基因的全長(zhǎng)ORF序列并測(cè)序。對(duì)NP、P、M、F、HN基因核苷酸同源性進(jìn)行比較、序列和進(jìn)化分

3、析，得出HN09-69株與傳統(tǒng)疫苗株LaSota、Clone-30、VG/GA、F48E8、Mukteswar同源性較低，而與水禽分離株FP1-02、SD09、SF02、SDWF02、ZJ1同源性較高，均在96％以上，并與兩鴨源分離株SD09、SF02在同一進(jìn)化分支上，從基因分型上得出HN09-69株屬于當(dāng)前流行的Ⅶd型。對(duì)各基因進(jìn)行基于氨基酸序列的生物信息學(xué)分析，表明F、HN存在信號(hào)肽和跨膜區(qū)。
　　 其次，分別以構(gòu)建的克隆質(zhì)

4、粒為模板，用上下游分別含BamHⅠ、XhoⅠ位點(diǎn)的引物，亞克隆NP、P、V基因的ORF及M(1-798bp)、F(1119-1506bp)、HN(675-1116bp)基因片段插入到原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，成功構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒。將鑒定正確的原核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)宿主菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，各重組質(zhì)粒在BL21(DE3)菌中獲得了高效表達(dá)，分別在相應(yīng)位置上出現(xiàn)明顯的目的蛋白條

5、帶，且NP、P蛋白以可溶性蛋白形式表達(dá)，M、F、HN、V蛋白以包涵體蛋白形式表達(dá)。然后對(duì)各蛋白表達(dá)的條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)蛋白進(jìn)行Western-blot鑒定。用Ni親和層析柱對(duì)NP、P進(jìn)行大量純化，后與適量的佐劑混合乳化，做成疫苗，免疫42日齡SPF雞(300ag/只)。二免后第7天開(kāi)始采血，并每隔7天采血一次，第21天用F48E8株進(jìn)行攻毒，觀察結(jié)果LaSota免疫組的保護(hù)率為100％，NP蛋白免疫組和對(duì)照組保護(hù)率為0，P蛋白免疫組保護(hù)