山羊副流感病毒3型HN基因原核表達(dá)與單克隆抗體的制備.pdf

1、副流感病毒3型（parainfluenza virus type3，PIV3）屬于副粘病毒科呼吸道病毒屬，是囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，是引起人和動物呼吸道疾病的重要病原，包括：人副流感病毒3型（Human parainfluenza virus type3，HPIV3）和牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type3，BPIV3）。目前國內(nèi)外對HPIV3與BPIV3的研究報道較為廣泛，但PIV3在羊群

2、中的感染情況在國內(nèi)外都鮮有報道。本實驗室從發(fā)病山羊中分離出一株新的PIV3病毒，命名為為山羊副流感病毒3型（Caprine parainfluenza virus3，CPIV3）JS2013。因此為監(jiān)測該病在羊群中的流行情況，急需建立一種病原學(xué)及血清學(xué)檢測方法，為開展流行病學(xué)調(diào)查提供依據(jù)。
　　PIV3基因組至少編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，即NP、P、M、F、HN和 L蛋白，其中HN蛋白和F蛋白是副流感病毒3型的主要保護性抗原。HN蛋白存在

3、至少6個抗原表位，其N端具有強烈的疏水性，從而使HN蛋白能夠牢固地嵌入病毒囊膜的雙層質(zhì)膜內(nèi)，3個中和性抗原表位均存在于其中。因此本研究利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，成功表達(dá)PIV3 JS2013重組蛋白His-HN，并制備出針對CPIV3 HN的單克隆抗體，以期為副流感病毒3型診斷方法的建立和HN蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容包括：
　　1、CPIV3 JS2013 HN基因片段克隆與表達(dá)
　　參考GenBank中

4、發(fā)表的牛副流感病毒3型（BPIV3）內(nèi)蒙09毒株（NM09）全基因組序列（GenBank登錄號: JQ063064），設(shè)計一對特異性引物擴增山羊副流感病毒3型（CPIV3）JS2013株HN基因部分序列，將擴增得到的基因進行測序，比對分析其與已報道 HPIV3、BPIV3的序列同源性最高分別為74.3％、79.8%。進化分析表明JS2013株并不屬于HPIV3與BPIV3，形成一個獨立的分支。將HN基因片段克隆至原核表達(dá)載體pET-32

5、a（+），獲得原核重組質(zhì)粒pET-32a-HN。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)菌株中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE與 His抗體western blot試驗分析表明，重組蛋白His-HN誘導(dǎo)表達(dá)成功，并以包涵體形式存在，大小約為46 ku。Western blot試驗驗證重組蛋白免疫BALB/c小鼠制備的高免血清能夠與重組蛋白反應(yīng)；病毒接種MDBK細(xì)胞后，間接免疫熒光（IFA）試驗表明其多克隆抗體與病毒產(chǎn)生

6、特異性熒光反應(yīng)，表明該重組蛋白具有很好的免疫原性和反應(yīng)原性。
　　2、CPIV3 JS2013 HN基因單克隆抗體的制備與鑒定
　　用純化后的重組蛋白免疫BALB/c小鼠，制備鼠抗His-HN蛋白的單克隆抗體。按照常規(guī)方法制備SP2/0骨髓瘤細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞進行融合，用間接ELISA篩選陽性克隆，采用有限稀釋法進行亞克隆，經(jīng)過3次亞克隆后篩選出3株能夠穩(wěn)定分泌抗His-HN蛋白的單克隆抗體，將其分別命名為1F8、2D5、4A