青枯勞爾氏菌EP-1胞外多糖合成缺陷突變體篩選及生物學(xué)特征研究.pdf

1、青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)，又稱青枯菌，起初命名為青枯假單胞桿菌（Pseudomonas solanacearum），革蘭氏陰性菌，是一種土傳植物細(xì)菌性青枯病的病原菌。青枯菌環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、寄主范圍廣，可危害40多個(gè)科的數(shù)百種植物，嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害巨大。
　　本實(shí)驗(yàn)利用廣東地區(qū)常見的強(qiáng)毒力青枯菌菌株EP-1構(gòu)建Tn5插入突變體庫，在24,500個(gè)克隆中篩選得到15個(gè)胞外多糖明顯減少的

2、突變體，利用hiTAIL-PCR方法獲得突變基因的全序列，通過酶活生物測(cè)定、生物膜檢測(cè)、運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)和接種試驗(yàn)分析突變體的表型與致病性，進(jìn)一步利用qRT-PCR技術(shù)分析相關(guān)基因表達(dá)量的差異，為進(jìn)一步研究青枯菌胞外多糖致病性及調(diào)控機(jī)理和構(gòu)建快速鑒定青枯菌致病力強(qiáng)弱的方法奠定基礎(chǔ)。結(jié)果如下：
　　1.篩選得到的15個(gè)胞外多糖明顯減少的突變體，分別命名為Em2、Em3、Em4、Em28、Em29、Em31、Em32、Em36、Em37、E

3、m51、Em56、Em58、Em60、Em61和Em64。另外，獲得青枯菌菌株EP-1、GMI1000、從番茄和花生分離得到的TM-1和PN-1菌株分別傳代培養(yǎng)至60代、25代和30代得到EP-60、GMI1000-25、TM-30和PN-30。
　　2.通過hiTAIL-PCR方法確定突變體插入基因位點(diǎn)。比對(duì)分析表明，突變體Em2、Em3、Em4、Em29、Em31和 Em37突變?cè)谙嗤?phcA的不同位點(diǎn)，該基因全長104

4、4bp，編碼347個(gè)氨基酸，是青枯菌致病性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心調(diào)控因子；突變體Em28突變?cè)诨騟psB中，該基因全長2256bp，編碼751個(gè)氨基酸，位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)下游，與其胞外多糖的分泌密切相關(guān)；突變體Em32突變?cè)诨駽MR15-30160中，該基因全長690bp，編碼229個(gè)氨基酸，具體功能未知；突變體Em36突變?cè)诨騡stO中，該基因全長690bp，編碼229個(gè)氨基酸，與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的合成有關(guān)；突變體 Em51突變?cè)诨騪stS2

5、中，該基因全長1062bp，編碼353個(gè)氨基酸，可能與磷酸鹽結(jié)合的周質(zhì)前體ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的的合成有關(guān)；突變體Em56突變?cè)诨騛sd中，該基因全長1104bp，編碼367個(gè)氨基酸，可能與天冬氨酸半醛脫氫酶氧化還原有關(guān)；突變體Em58突變?cè)诨騌Sc1351中，該基因全長1245bp，編碼414個(gè)氨基酸，可能是組氨酸激酶跨膜轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白感受器；突變體Em60突變?cè)诨騌Sc1584中，該基因全長441bp，編碼146個(gè)氨基酸，推測(cè)為假定轉(zhuǎn)

6、錄調(diào)控因子；突變體Em61突變?cè)诨騌Sc1620中，該基因全長243bp，編碼80個(gè)氨基酸，是假定跨膜蛋白；突變體 Em64突變?cè)诨騪ckG中，該基因全長1869bp，編碼622個(gè)氨基酸，可能是磷酸羧化酶蛋白。
　　3.通過qRT-PCR檢驗(yàn)分析表明，突變基因?qū)е翬P-1胞外多糖相關(guān)基因和編碼群體感應(yīng)信號(hào)基因phcB的表達(dá)量降低；接種寄主植物表明致病性減弱，還對(duì)運(yùn)動(dòng)性及生物膜的形成產(chǎn)生影響。
　　4.初步建立了鑒定青枯菌