定植于桉樹(shù)根產(chǎn)酸克雷伯氏菌突變體的篩選及其功能基因.pdf

1、桉樹(shù)（Eucalyptus robusta）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，但其生長(zhǎng)過(guò)程耗肥大，目前實(shí)際生產(chǎn)中大量施用化肥以滿足其生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求，因此帶來(lái)一系列負(fù)面影響。自生固氮菌能與多種植物形成聯(lián)合固氮體系，具有一定利用的價(jià)值。
　　本文從桉樹(shù)林分離篩選出一株自生固氮菌，命名為KO108。采用PCR技術(shù)克隆16SrRNA基因可變區(qū)序列，在NCBI上的登陸號(hào)為KM460926.1。同時(shí)利用常規(guī)鑒定方法并結(jié)合Biolog微生物鑒定系統(tǒng)，鑒定該

2、菌株為革蘭氏陰性產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca），屬于腸桿菌科(Enterbateriaceae)克雷伯氏菌屬（Klebsiella）。
　　利用藥敏試紙對(duì)菌株KO108進(jìn)行抗生素抗性檢測(cè)，結(jié)果表明該菌株對(duì)呋喃妥因、鏈霉菌、頭孢曲松、卡那霉素、氧氟沙星、強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星、氯霉素敏感;對(duì)復(fù)方新諾明中度敏感;對(duì)多粘菌素、青霉素G、四環(huán)素、紅霉素不敏感，青霉素G對(duì)其的抑菌圈直徑為0。
　　以轉(zhuǎn)座子[mTn5

3、gusA-pgfp21]對(duì)產(chǎn)酸克雷伯氏菌KO108進(jìn)行突變，篩選能定植于桉樹(shù)根系表面的突變體，嘗試建立一種木本植物與固氮細(xì)菌的互利促生體系。
　　菌株KO108和Escherichia coliS17.1兩親結(jié)合，經(jīng)轉(zhuǎn)座子[mTn5gusA-pgfp21]結(jié)合轉(zhuǎn)移并隨機(jī)插入突變建立KO108的Kan抗性標(biāo)記，GUS活性，GFP遺傳標(biāo)記的突變體庫(kù)。隨機(jī)選擇突變體，以750bp GFP綠色熒光蛋白序列為探針Southern雜交，結(jié)果顯

4、示轉(zhuǎn)座子[mTn5gusA-pgfp21]為單插入，片段大小不同，驗(yàn)證結(jié)果顯示該突變體庫(kù)隨機(jī)性良好。
　　以桉樹(shù)根與突變體庫(kù)共同培養(yǎng)篩選可以定植于桉樹(shù)根的突變體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2株較穩(wěn)定地附著于桉樹(shù)根系表面，編號(hào)為MA和MD，但野生菌株KO108不能定植于桉樹(shù)根。
　　以轉(zhuǎn)座子[mTn5gusA-pgfp21]的GUS1和IS50R端各1條引物對(duì)Sau3AⅠ的酶切MA和MD基因組的自連產(chǎn)物進(jìn)行反向PCR，分別得到一段671bp和

5、195bp的片段，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast比對(duì)結(jié)果顯示MA的[mTn5gusA-pgfp21]插入位點(diǎn)所在片段與產(chǎn)酸克雷伯氏菌NAD(P)H醌類氧化還原酶基因核苷酸水平有87％一致性，而MD與產(chǎn)酸克雷伯氏菌LPS脂多糖生物合成基因簇核苷酸水平有99％一致性。
　　采用Epicentre pWEBTM Cosmid Cloning Kit構(gòu)建KO108基因組文庫(kù)，克隆數(shù)目為1329個(gè)。通過(guò)EcoRⅠ酶切分析隨機(jī)挑取的20個(gè)文庫(kù)克

6、隆的重組質(zhì)粒，結(jié)果顯示所有質(zhì)粒均有8.179 bp載體條帶同時(shí)含有外源DNA，且外源DNA的帶型并不相同，這表明所構(gòu)建的KO108基因組文庫(kù)中插入的外源DNA隨機(jī)性較好。分析EcoRⅠ酶切隨機(jī)挑取的20個(gè)文庫(kù)克隆的重組質(zhì)粒的外源DNA電泳條帶的大小，結(jié)果顯示克隆的外源DNA片段最小約為25 kb，最大約為50kb，平均大小估算為40 kb，文庫(kù)克隆容量約52 Mb，證明該基因組文庫(kù)包含基因組任意一個(gè)基因的概率為99.8％，是KO108基