谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白載體的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白也稱興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白（Excitatory amino acid transporter,EAAT）主要存在于神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞漿膜上，EAAT轉(zhuǎn)運谷氨酸是離子依賴的耗能過程。目前認為，細胞外沒有使谷氨酸代謝失活的酶，而使谷氨酸在神經(jīng)系統(tǒng)滅活的唯一途徑是通過神經(jīng)細胞的再攝取和吸收，其中起主要作用的是位于神經(jīng)膠質(zhì)細胞上的EAAT2和位于神經(jīng)元上的EAAT3。本課題擬構(gòu)建EAAT2和EAAT3的表達載體，為與EAAT2

2、和EAAT3減少的相關中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供一定的基礎。
　　實驗一重組腺病毒EAAT2的構(gòu)建及鑒定
　　目的：利用基因克隆技術克隆EAAT2基因全長cDNA，并構(gòu)建及鑒定其重組腺病毒載體。
　　方法：從大鼠腦組織中用RT-PCR方法得到EAAT2的基因全長片斷，將其導入T載體進行測序，得到準確的序列后再導入腺病毒穿梭質(zhì)粒當中。將穿梭質(zhì)粒和病毒骨架通過電穿孔導入細菌內(nèi)進行重組，挑選陽性克隆，提取重組后的質(zhì)粒，用脂質(zhì)體法將

3、其在體外轉(zhuǎn)染入HEK293細胞，并在細胞內(nèi)部包裝。用倍比稀釋感染法測定腺病毒的滴度。
　　結(jié)果：成功將EAAT2連入帶有綠色熒光的腺病毒載體中，病毒滴度為2×108pfu/ml。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了pAd/EAAT2載體，為EAAT2缺乏的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療和研究奠定了基礎。
　　實驗二大鼠EAAT3真核表達載體的構(gòu)建和在Hella細胞中的表達
　　目的：克隆大鼠谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白3（EAAT3）的cDNA，構(gòu)

4、建其真核表達載體并轉(zhuǎn)染Hella細胞。
　　方法：從大鼠的腦組織中提取RNA,采用RT-PCR技術擴增EAAT3的基因編碼區(qū)序列,將序列定向克隆至真核表達載體pcDNA3.1(+)。經(jīng)酶切及測序鑒定后用陽離子脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染到Hella細胞中，通過免疫印跡法鑒定其表達。
　　結(jié)果:經(jīng)雙酶切、測序鑒定證實EAAT3基因的真核表達載體構(gòu)建成功。免疫印跡法證實EAAT3基因的表達。
　　結(jié)論:成功克隆了EAAT3編碼區(qū)序列,并