乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、癲癇是一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病,通常是指大腦神經(jīng)元突然異常放電,導(dǎo)致各種臨床表現(xiàn)反復(fù)發(fā)作的慢性疾病。難治性癲癇也稱頑固性癲癇,一般情況下,每月發(fā)病超過(guò)1次,正確用藥超過(guò)3種,正規(guī)治療時(shí)間超過(guò)2年仍無(wú)療效者,可視為難治性癲癇[1]。大約30％的癲癇患者屬于難治性癲癇[2]。我國(guó)癲癇患病率約為5‰,其中難治性癲癇患者有上百萬(wàn)名,給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神負(fù)擔(dān)。幾十年來(lái),利用體外及體內(nèi)癲癇發(fā)作模型努力探討自發(fā)性癲癇反復(fù)發(fā)作(癲癇病患者的大

2、腦的決定性標(biāo)志)的分子和細(xì)胞機(jī)制。盡管我們?cè)诶斫獍d癇發(fā)生中獲得巨大的進(jìn)步,但是調(diào)查人員仍然沒(méi)有制定可靠致癇病灶的生物標(biāo)志物或替代標(biāo)志物。目前對(duì)于導(dǎo)致癲癇發(fā)生的病理機(jī)制知之甚少,尤其是累積事件比如頭部外傷,炎癥,或長(zhǎng)期熱性驚厥所觸發(fā)的癲癇[3]。癲癇治療面臨的主要挑戰(zhàn)是癲癇固有的復(fù)雜性和異質(zhì)性以及癲癇發(fā)作表現(xiàn)出的不同的遺傳易感性。因此,癲癇發(fā)作共享一個(gè)基本病理生理機(jī)制是不可能的。過(guò)去幾十年來(lái),抗癲癇治療的總目標(biāo)是影響或者阻止原發(fā)性癲癇發(fā)作

3、的急性過(guò)[4-6]。目前癲癇治療一方面是急需要針對(duì)疾病發(fā)展變化的治療,全面或部分阻止癲癇發(fā)作的反復(fù)發(fā)作。癲癇治療的另一方面是減少或阻止癲癇發(fā)作所致的并發(fā)癥。比如認(rèn)知障礙,心理障礙所造成的危害。迄今為止,在動(dòng)物模型中驗(yàn)證的癲癇發(fā)病過(guò)程中的分子和細(xì)胞改變包括:神經(jīng)元損傷和細(xì)胞死亡,軸突和樹(shù)突的可塑性,突觸前和突觸后的修飾,神經(jīng)發(fā)生,神經(jīng)炎癥,膠質(zhì)細(xì)胞活化,血管損傷和血管生成,細(xì)胞外基質(zhì)破裂,離子通道結(jié)構(gòu)和功能的改變[7]。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)癲

4、癇發(fā)生和能量代謝失衡關(guān)系密切,能量代謝物質(zhì)不平衡可以誘發(fā)癲癇發(fā)生。比如谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),多種致癇機(jī)制通過(guò)谷氨酸遞質(zhì)及其受體途徑導(dǎo)致癲癇發(fā)生。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道乳酸及乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在動(dòng)物模型的癲癇發(fā)生中起到重要作用,轉(zhuǎn)運(yùn)體的活動(dòng)不僅直接反映突觸信息的傳遞,當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn)體的重?cái)z取功能異常,就可以導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)在突觸間隙的濃度變化,從而引起病理生理改變,如果突觸前遞質(zhì)質(zhì)量異常,不僅突觸后的受體出現(xiàn)數(shù)量改變,而且

5、突觸前的轉(zhuǎn)運(yùn)體也會(huì)發(fā)生代償性變化,這種轉(zhuǎn)運(yùn)體的改變要比受體的改變更敏感、更直接。近年來(lái)一些研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)癲癇的發(fā)生和抗癲癇藥的作用機(jī)理、新藥開(kāi)發(fā)都出現(xiàn)了新的看法?；诖?我們進(jìn)行以下研究:
　　第一部分 MCT4在癲癇動(dòng)物模型和臨床癲癇樣本表達(dá)分析
　　目的:研究MCT4在癲癇動(dòng)物模型和臨床癲癇樣本表達(dá)情況。方法:從第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科標(biāo)本庫(kù)中隨機(jī)選取30例顳葉癲癇組織標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組,12例外傷組織標(biāo)本作為對(duì)照組。

6、將大鼠分為生理鹽水對(duì)照組、SE4h、SE12h、SE1d、SE3d、SE7d、SE14d、SE28d、SE60d組,每組8只。建立大鼠氯化鋰-匹羅卡品模型,在模型建立成功后在不同時(shí)間點(diǎn)收集大鼠顳葉及海馬組織。利用西式印跡檢測(cè)MCT4在癲癇大鼠皮層及海馬組織表達(dá),利用西式印跡和免疫組織化學(xué)檢測(cè)MCT4在癲癇樣本中表達(dá)情況,同時(shí)對(duì)臨床癲癇樣本進(jìn)行甲基化PCR分析。結(jié)果:在西式印跡實(shí)驗(yàn)中,MCT4在癲癇模型顳葉皮層中急性期開(kāi)始表達(dá)降低,在潛伏

7、期表達(dá)達(dá)到最低水平,MCT4在海馬的表達(dá)和顳葉皮層基本一致。在臨床癲癇樣本中MCT4表達(dá)降低。利用甲基化PCR方法證實(shí)MCT4在癲癇樣本中表達(dá)減少與MCT4啟動(dòng)子區(qū)過(guò)渡甲基化有關(guān)。結(jié)論:無(wú)論是在癲癇模型還是臨床癲癇樣本中,MCT4表達(dá)均降低,研究還發(fā)現(xiàn)MCT4在癲癇樣本中表達(dá)減少與MCT4啟動(dòng)子區(qū)過(guò)渡甲基化有關(guān),這提示MCT4可能與癲癇發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。
　　第二部分 MCT4在癲癇發(fā)病中的作用分析
　　目的:研究MCT4在

8、癲癇發(fā)病中的作用。方法:建立大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)模型,在模型建立成功后將含有MCT4shRNA的慢病毒顆粒感染原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞,然后通過(guò)細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)鑒定。利用MTT方法驗(yàn)證干涉MCT4對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖能力的影響。同時(shí)采用流式細(xì)胞儀技術(shù),驗(yàn)證干涉MCT4對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期影響。利用MCT4阻斷劑阻斷MCT4信號(hào),觀察阻斷MCT4信號(hào)對(duì)神經(jīng)元電活動(dòng)影響。結(jié)果:成功構(gòu)建MCT4干涉的原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)

9、胞模型,MTT結(jié)果顯示原代星形膠質(zhì)細(xì)胞干涉MCT4后,細(xì)胞增殖能力顯著減弱。流式結(jié)果證實(shí)原代細(xì)胞中干涉MCT4后,顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡。流式結(jié)果也證實(shí)原代細(xì)胞中干涉MCT4后導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯。膜片鉗結(jié)果證明:給予癲癇大鼠海馬MCT4信號(hào)阻斷劑后,神經(jīng)元興奮性增加。結(jié)論:在大鼠的原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞中干涉MCT4可以導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力減弱,流式細(xì)胞儀技術(shù)分析顯示干涉MCT4促進(jìn)細(xì)胞凋亡并且導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯。而且干涉MCT4后促使神經(jīng)

10、元興奮性增高。這些結(jié)果提示MCT4在正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、凋亡以及細(xì)胞周期方面扮演重要作用,并且MCT4表達(dá)對(duì)維持正常神經(jīng)元興奮性表達(dá)起到重要作用,因此MCT4在癲癇患者病灶中表達(dá)減少,可能是癲癇反復(fù)發(fā)作的一個(gè)重要原因。
　　第三部分 MCT4在癲癇發(fā)病中調(diào)控機(jī)制研究
　　目的:研究MCT4在癲癇發(fā)病中調(diào)控機(jī)制研究。方法:建立大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)模型,在模型建立成功后將含有MCT4shRNA的慢病毒顆粒感染原代培養(yǎng)

11、星形膠質(zhì)細(xì)胞,然后收集蛋白利用西式印跡方法檢測(cè)EAAT1表達(dá)情況。利用免疫共沉淀檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞中MCT4是否和EAAT1相互結(jié)合。同時(shí)對(duì)所用癲癇樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,檢測(cè)MCT4和EAAT1在癲癇樣本中表達(dá)情況。在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中加入放線菌酮,觀察干涉MCT4后對(duì)EAAT1穩(wěn)定性是否有影響。結(jié)果:大鼠星膠質(zhì)細(xì)胞中干涉MCT4后可以導(dǎo)致EAAT1表達(dá)降低,免疫共沉淀證明了在原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞中MCT4和EAAT1是相互結(jié)合

12、的。免疫組織化學(xué)證實(shí)癲癇病灶中MCT4和EAAT1表達(dá)具有臨床相關(guān)性。放線菌酮實(shí)驗(yàn)證實(shí),在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中干涉MCT4可以導(dǎo)致EAAT1穩(wěn)定性減弱。結(jié)論:星形膠質(zhì)細(xì)胞中干涉MCT4可以導(dǎo)致EAAT1表達(dá)減少,并且免疫共沉淀也證實(shí)了在星形膠質(zhì)細(xì)胞中EAAT1和MCT4相互作用,這提示在星形膠質(zhì)細(xì)胞中MCT4可能調(diào)控EAAT1表達(dá)。斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)性分析證實(shí)了MCT4和EAAT1在癲癇病灶中的表達(dá)具有臨床相關(guān)性。放線菌酮實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證