骨關(guān)節(jié)炎改良Hulth模型的實驗研究.pdf

1、骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是多種因素引起的以關(guān)節(jié)軟骨退變和軟骨下骨重塑及骨贅形成為病理特征的關(guān)節(jié)疾患。近年來，OA的發(fā)病率逐年增高，已成為老年人致殘的主要疾病之一。合適的動物模型是大規(guī)模開展OA基礎(chǔ)和臨床研究的基石。幾十年來國內(nèi)外相繼報道了多個動物模型，然而各個模型的系統(tǒng)研究仍待深入。既往研究已證實OA患者的血液及關(guān)節(jié)液的成分較正常人及其他炎性關(guān)節(jié)病有明顯的不同，說明隨著OA的發(fā)生、發(fā)展，病變可以通過體液環(huán)境反映出來

2、，進而對體液環(huán)境產(chǎn)生重要的影響。反之，參與關(guān)節(jié)疾病的各種細胞生活在改變了的體液環(huán)境中，必然會因?qū)Νh(huán)境產(chǎn)生變化。本試驗通過改良Hulth法造模后，對此模型進行了系列研究，并比較不同時期骨關(guān)節(jié)炎兔血清對軟骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的影響，為探討骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制及骨關(guān)節(jié)炎軟骨修復時機等提供實驗依據(jù)。 目的：1.通過觀察改良Hulth法造模后不同時期兔膝關(guān)節(jié)的大體和病理特點，研究其復制不同時期骨關(guān)節(jié)炎的可行性；2.對造模后不同時期兔

3、血清NO含量、軟骨細胞凋亡率及軟骨Ⅱ型膠原和蛋白多糖mRNA進行檢測，為此模型提供實驗依據(jù)并探討骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制；3.對造模不同時期軟骨細胞進行培養(yǎng)，并觀察不同時期骨關(guān)節(jié)炎血清環(huán)境對正常軟骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的影響，進而探討血清學環(huán)境與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病及軟骨修復的關(guān)系。 方法：1.取成年新西蘭大白兔16只，雌雄各半，隨機分組，對Hulth造模法進行改良，將兔右膝關(guān)節(jié)作為實驗側(cè)，作膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶切斷、內(nèi)側(cè)半月板切除，左膝作為

4、對照側(cè)。分別于造模后2，6，10，14周時觀察膝關(guān)節(jié)的大體和組織病理學特點。軟骨病理采用Mankin評分進行評定。2.提取造模前及造模后不同時期兔血清，冷凍保存，參照改良Gress法對血清NO含量進行檢測。3.采用TUNNEL軟骨細胞凋亡檢測法，對造模后不同時期骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡情況進行流失細胞儀檢測。4.應用RT-PCR的方法，檢測造模后不同時期骨關(guān)節(jié)炎軟骨與正常軟骨collagenⅡ和aggrecan的表達情況，β-actin作為

5、內(nèi)參照。5.采用酶消化培養(yǎng)法對造模后不同時期，實驗側(cè)及對照側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨細胞進行消化培養(yǎng)，利用倒置相差顯微鏡觀察體外培養(yǎng)的軟骨細胞的形態(tài)學變化和生物學特性，采用MTT法檢測其細胞增殖情況。6.取凍存的正常及造模后不同時期兔血清，與正常幼兔軟骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞進行培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化，MTT法檢測細胞增殖情況。 結(jié)果：1.對照各組各時間點Mankin評分無統(tǒng)計學差異（P>0.05），造模各組與對照組，及造模各組間

6、Mankin評分有統(tǒng)計學差異（P<0.01）；2.正常組和造模2周組與造模6周、10周、14周組血清NO含量有統(tǒng)計學差異（P<0.01），造模6周、10周及14周組間無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；3.經(jīng)X2檢驗各時間點軟骨細胞凋亡率有統(tǒng)計學差異（P<0.01）；4.造模各組與正常組相比，及造模各組之間collagenⅡ和aggrecan mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。5.各時間點實驗側(cè)與對照側(cè)原代軟骨細胞增殖活性有統(tǒng)計學

7、差異（P<0.01）。尤其是造模10周時，有明顯差異（P<0.001）6.不同時期骨關(guān)節(jié)炎兔血清對正常軟骨細胞和MSC細胞形態(tài)和增殖有重要影響。 結(jié)論：（1）采本研究通過改良Hulth模型，14周內(nèi)成功復制出膝不同時期骨關(guān)節(jié)炎，證實了此種改良方法的可行性；血清NO含量增高，NO含量造模6周后與病理分期無明確相關(guān)。而隨著病理分級進展，軟骨細胞凋亡率相應增加；Ⅱ型膠原和蛋白多糖mRNA的表達，造模一段時間都有增高的趨勢，在造模10周

8、達到最高峰，然而在極晚期病變出現(xiàn)時，又都快速下降，與病理進展有一定相關(guān)性；（2）本實驗采用原代軟骨細胞機械分離及胰蛋白酶、Ⅰ型及Ⅱ膠原酶的序貫、聯(lián)合消化法，可以對骨關(guān)節(jié)炎原代軟骨細胞進行良好的分離和傳代培養(yǎng)。體外培養(yǎng)在造模中晚期，病變側(cè)軟骨細胞增殖能力強于正常對照側(cè)，且形態(tài)學差異不大。并提出采用骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞作為軟骨組織工程種子細胞來源的可能性；（3）本研究發(fā)現(xiàn)，造模不同時期骨關(guān)節(jié)炎兔血清對正常軟骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學行為具