一氧化氮誘導(dǎo)縫隙連接蛋白43在人眼和牛眼睫狀體表達(dá)的研究.pdf

1、縫隙連接(gap junction,GJ)為溝通相鄰細(xì)胞胞質(zhì)的胞間通道,其在細(xì)胞膜上緊密聚集成簇,通過介導(dǎo)細(xì)胞間縫隙連接通訊(gap junctional intercellularcommunication,GJIC)參與胞間物質(zhì)、能量的交換和信息的傳遞,因而對(duì)細(xì)胞的生長、發(fā)育和分化,神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的維持具有重要作用。
　　 縫隙連接蛋白(Connexins,Cxs)為一類具有較高同源性的蛋白超家族,是構(gòu)成GJ的

2、基本單位。在眼部,Cxs已被證實(shí)存在于角膜、晶狀體、虹膜、睫狀體、視網(wǎng)膜等多處。Connexin43作為主要的縫隙連接蛋白,在睫狀體中主要表達(dá)于雙層上皮細(xì)胞,而在睫狀肌和基質(zhì)中則未見表達(dá)。鑒于Cx43特定的表達(dá)位置及其功能上的重要性,越來越多的研究者開始關(guān)注其與房水生成之間的聯(lián)系,并圍繞Cx43的磷酸化調(diào)控,以及Cx43與房水生成相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了一些列相關(guān)研究。
　　 在眼部,一氧化氮合酶(nitric oxide synthas

3、e,NOS)含量豐富,其催化生成的一氧化氮(nitric oxide,NO)作為一種活躍的信號(hào)分子,可以通過激活腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase,AC)與鳥苷酸環(huán)化酶(guanylyl cyclase,GC)來增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)第二信使環(huán)磷酸腺苷(adenosine3’,5’-cyclic monophosphate)和環(huán)磷酸烏苷(guanosine3’,5’-cyclic monophosphate,cGMP)的表達(dá)。后者作為

4、細(xì)胞間重要的第二信使在調(diào)控Cx43表達(dá)和通道功能上起重要作用,且一些藥物能夠加強(qiáng)或者減弱該作用。眼內(nèi)可能存在多種信號(hào)通路,通過調(diào)節(jié)Cx43的表達(dá)和通道功能而影響房水生成過程。
　　 本研究旨在研究縫隙連接蛋白Cx43在離體人眼和牛眼睫狀體的表達(dá)與分布,以及No對(duì)其表達(dá)的調(diào)控作用,我們目前的研究結(jié)果提示NO作為一種有效的刺激物能夠促進(jìn)睫狀體雙層上皮細(xì)胞間Cx43的表達(dá),并且進(jìn)一步證實(shí)了NO的該種作用主要依賴于其下游的cGMP/PK

5、G及cAMP/PKA信號(hào)通路的激活。本研究對(duì)進(jìn)一步研究房水生成分子機(jī)制,了解某些抗青光眼藥物的降眼壓機(jī)制具有重要意義。具體包括:
　　 第一部分
　　 一氧化氮合酶和鳥苷酸環(huán)化酶在人眼睫狀體和小梁網(wǎng)中的表達(dá)及分布的研究
　　 [研究目的]
　　 研究神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOs),誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxid

6、e synthase,iNOS),內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)及鳥苷酸環(huán)化酶(guanylyl cyclase,GC)在人眼睫狀體和小梁網(wǎng)的表達(dá)與分布。
　　 [材料和方法]
　　 收集10例眼外傷后48小時(shí)內(nèi)摘除的病人眼球(排除其他眼部病史),常規(guī)石蠟包埋、切片,HE染色光鏡下觀察。切片脫色素后以免疫組織化學(xué)Envision二步法檢測nNOs、iNO

7、s、eNOs及GC在睫狀體中和小梁網(wǎng)中的表達(dá),以磷酸緩沖液(PBS)代替上述各種一抗作為陰性對(duì)照。光鏡下讀片以顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞密度相結(jié)合作為定性指標(biāo)。
　　 [研究結(jié)果]
　　 三種一氧化氮合酶(NOS)及鳥苷酸環(huán)化酶(GC)在離體人眼睫狀體上皮、睫狀肌、小梁網(wǎng)和Schlemm's管內(nèi)皮中均有廣泛表達(dá)。在睫狀體中,nNOS表達(dá)較強(qiáng),主要表達(dá)在色素上皮(PE)和非色素(NPE)上皮細(xì)胞胞漿的頂端交界處。iNOS及eNOs

8、在PE與NPE兩種上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)均勻表達(dá)。在部分睫狀突中,GC在PE和NPE細(xì)胞胞漿中均勻分布,而在其他睫狀突中,GC在PE和NPE細(xì)胞胞漿頂端交界處表達(dá)較強(qiáng)。
　　 [研究結(jié)論]
　　 三種NOS亞型及GC在離體人眼睫狀體上皮、睫狀肌、小梁網(wǎng)和Schlemm's管內(nèi)皮中均有廣泛表達(dá)。nNOS和GC的特定表達(dá)模式提示NO/cGMP信號(hào)通路其可能參與了人眼睫狀體跨上皮細(xì)胞間離子轉(zhuǎn)運(yùn),因而可能參與了房水生成的調(diào)節(jié)一過程。

9、r>　　 第二部分縫隙連接蛋白connexin43及connexin40在離體人眼和牛眼睫狀體中的表達(dá)
　　 [研究目的]
　　 研究兩種常見的縫隙連接蛋白即縫隙連接蛋白43(Connexin43,Cx43)和縫隙連接蛋白40(connexin40,Cx40)在正常人眼和牛眼睫狀體的表達(dá)及分布。
　　 [材料和方法]
　　 收集10例眼外傷后48小時(shí)內(nèi)摘除的病人眼球(排除其他眼部病史)和10例當(dāng)?shù)赝涝讏?/p>

10、新鮮摘取的牛眼球(排除眼球破裂和眼內(nèi)炎眼球),常規(guī)石蠟包埋、切片,HE染色光鏡下觀察。切片脫色素后以免疫組織化學(xué)EnVision二步法檢測Cx43和Cx40在離體人眼睫狀體中的表達(dá),以及Cx40在離體牛眼睫狀體的表達(dá)。以磷酸緩沖液(PBS)代替上述各種一抗作為陰性對(duì)照。光鏡下讀片以顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞密度相結(jié)合作為定性的指標(biāo)。
　　 [研究結(jié)果]
　　 Cx43在離體人眼及牛眼睫狀體中均存在基礎(chǔ)表達(dá)。其陽性染色密集分布于色

11、素上皮(PE)和非色素(NPE)上皮細(xì)胞胞漿頂端交界處。部分見于PE細(xì)胞交界處與其胞漿內(nèi)。Cx40在離體人眼睫狀體組織呈陰性表達(dá)。
　　 [研究結(jié)論]
　　 Cx43在離體人眼和牛眼睫狀體上皮的分布模式,Cx43通道可能作為人眼和牛眼睫狀體上皮細(xì)胞間主要的縫隙連接通道來參與房水生成。
　　 第三部分NO-cGMP/cAMP信號(hào)通路對(duì)人眼與牛眼睫狀體Connexin43表達(dá)影響的研究
　　 [研究目的]

12、r>　　 研究一氧化氮(Nitric Oxide,NO)及其下游信號(hào)分子環(huán)磷酸腺苷(Adenosine3’,5’-cyclic monophosphate,cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(Guanosine3’,5’-cyclicmonophosphate,cGMP)對(duì)離體人眼和牛眼睫狀體縫隙連接蛋白43(Connexin43,Cx43)表達(dá)的調(diào)控作用及可能機(jī)制。
　　 [材料和方法]
　　 蛋白印跡(Westem blot)

13、法分別檢測離體人眼和牛眼睫狀體中Cx43蛋白的表達(dá)。將睫狀體組織分別與與NO供體硝普鈉(SNP,100μM)、cAMP替代物8-Bromo-cAMP(250pM)和cGMP替代物8-Bromo-cGMP(500μM)共同孵育18小時(shí),并用上述藥物下游通道的抑制劑阻斷其效應(yīng),半定量分析對(duì)照組、SNP組、8-Bromo-cAMP組、8-Bromo-cGMP組和各抑制劑組Cx43蛋白表達(dá)的差異。
　　 [研究結(jié)果]
　　 蛋白

14、印跡法檢測到Cx43在離體人眼及牛眼睫狀體存在基礎(chǔ)表達(dá)。SNP,8-Bromo-cAMP,8-Bromo-cGMP能在18小時(shí)內(nèi)顯著增加Cx43蛋白的基礎(chǔ)表達(dá),PKA抑制劑H89在一定程度上抑制了SNP和82Bromo-cAMP對(duì)Cx43蛋白表達(dá)量的上調(diào)。PKG抑制劑KT5823在一定程度上能夠抑制SNP和8-Bromo-cGMP對(duì)Cx43蛋白表達(dá)量的上調(diào),sGC抑制劑ODQ在一定程度上可抑制SNP對(duì)Cx43蛋白表達(dá)量的上調(diào)。