縫隙連接參與一氧化氮緩解腦血管痙攣的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　縫隙連接（gap junction，GJ）是相鄰細(xì)胞間最直接快速的通訊方式，對(duì)維持血管細(xì)胞間的協(xié)同反應(yīng)起重要作用。在血管系統(tǒng)中共發(fā)現(xiàn)4種縫隙連接蛋白（connexion，Cx），包括Cx37、Cx40、Cx43和Cx45，Cx43和Cx45主要在平滑肌細(xì)胞表達(dá)，Cx40和Cx37主要在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。前期實(shí)驗(yàn)表明，縫隙連接通道與腦血管痙攣（Cerebral vasospasm，CVS）關(guān)系密切，CVS后縫隙連接蛋白表達(dá)及

2、分布發(fā)生改變。目前對(duì)CVS機(jī)制及治療尚不清楚，一氧化氮(NO)是血管最重要的舒張因子，蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后NO減少是誘發(fā)CVS的最重要因素之一。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，研究NO緩解CVS的分子機(jī)制及Cxs的表達(dá)變化，為SAH后CVS的治療提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.枕大池二次注血法構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性 SAH模型：SD大鼠10％水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔麻醉后，枕大池穿刺注射未肝素化新鮮自體動(dòng)脈血0.3ml，

3、清醒后正常喂養(yǎng)，24h后二次重復(fù)注血。
　　2.實(shí)驗(yàn)性SAH模型的檢測(cè)：分為對(duì)照組、假手術(shù)組及SAH組，在建立模型后的7d通過(guò)大鼠尾靜脈注入FITC-Dextran（標(biāo)記血小板），使用活體熒光顯微鏡檢測(cè)大腦中動(dòng)脈分支微血管直徑的變化，對(duì)比分析各組之間微血管的痙攣數(shù)量。
　　3. Cx40表達(dá)的變化：各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物被處死后立即斷頭取腦，顯微鏡下分離基底動(dòng)脈，將其剪成完整的動(dòng)脈條；使用外源性100μM DETA-NO、100μM

4、PKG激活劑8-Br-cGMP、100μM PKG抑制劑(D)-DT-2、100μM Cx40特異性阻斷劑40Gap27等藥物體外孵育動(dòng)脈條；Western Blotting檢測(cè)大鼠基底動(dòng)脈條縫隙連接蛋白40(Cx40)蛋白表達(dá)的變化。
　　4.游離腦血管環(huán)張力檢測(cè)：取各組SD大鼠基底動(dòng)脈環(huán)游離后使用藥物孵育動(dòng)脈條，用含前列環(huán)素抑制劑10μM吲哚美辛(Indo)、EDHF抑制劑1μM蜂毒肽(apamin)和0.05μM蝎毒素(ch

5、arybdotoxin)的PSS，通95%O2+5%CO2混合氣體預(yù)處理，60mmol/L KCl KPSS刺激預(yù)收縮，最后加入不同濃度 ACh（10-10-10-4mol/L），誘導(dǎo)基底動(dòng)脈環(huán)產(chǎn)生NO介導(dǎo)舒張反應(yīng)，通過(guò)powerlab生理信息采集與處理系統(tǒng)記錄各濃度ACh的張力值并計(jì)算出舒張百分比。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)枕大池二次注血法能夠構(gòu)建SAH模型，熒光顯微鏡可見(jiàn)可見(jiàn)大量收縮血管，其中以微小血管為主(p<0.05

6、 vs. Sham組)。大體標(biāo)本可見(jiàn)大量的血凝塊聚集在willis環(huán)、小腦延髓池、腦干腹側(cè)。
　　2. Western blotting檢測(cè)基底動(dòng)脈Cx40示：SAH后7d，基底動(dòng)脈Cx40蛋白表達(dá)輕微下調(diào)(49.1±7.1%)，與正常組(54.9±6.2%)相比較蛋白無(wú)明顯差異（p>0.05）；DETA-NO預(yù)處理后Cx40的蛋白表達(dá)上調(diào)(67.5±7.8%)；PKG激活劑8-Br-cGMP能夠模擬DETA-NO上調(diào)Cx40上調(diào)

7、(60.3±8.1%)；使用PKG阻滯劑(D)DT-2干預(yù)后能有效地抑制DETA-NO對(duì)Cx40的上調(diào)(44.4±7.2%)；Cx40特異性阻斷劑40Gap27可明顯抑制 DETA-NO誘導(dǎo) Cx40蛋白表達(dá)的增加(38±8.3%)。
　　3.游離血管環(huán)張力實(shí)驗(yàn)示：SAH后7d，基底動(dòng)脈NO介導(dǎo)舒張反應(yīng)明顯下降；使用DETA-NO預(yù)處理后能夠明顯緩解SAH能夠增強(qiáng)血管舒張功能；PKG激活劑8-Br-cGMP能夠模擬DETA-NO作