自發(fā)性高血壓大鼠NHE-1基因表達與左心室肥厚相關(guān)性研究.pdf

1、本研究通過熒光PCR技術(shù)從mRNA水平定量檢測自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)與年齡體重相匹配的同源正常血壓大鼠(wistar-Kyoto，WKY)心肌的NHE-1基因的表達情況。從基因水平上探討高血壓左室肥厚發(fā)生的機制，為防治高血壓左室肥厚提供實驗依據(jù)。 目的： 1、揭示自發(fā)性高血壓大鼠左室肥厚與NHE-1基因表達的相關(guān)性。 2、從基因水平探討高血壓致左室肥厚的機制，為防治高血壓左室肥厚提供理論依據(jù)。 研究方

2、法： 1、動物：自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和年齡體重相匹配的同源正常血壓大鼠(WKY)各20只，引自四川省人民醫(yī)院實驗動物研究中心(許可證號SCXK(111)2004-16)。雄雌各半，10～11周齡，體重173～294g，在同一室恒溫(22±3)、恒濕(60±5％)條件下飼養(yǎng)，人工光照明暗各12小時，自由取食和攝水。大鼠應(yīng)禁食12小時、不禁水的情況下使用電子天平進行稱體重，并記錄。 2、測壓方法：大鼠以戊巴比妥鈉50m

3、g/Kg腹腔內(nèi)注射，固定，行腹主動脈插管后接上美國惠普公司有創(chuàng)血流動力學(xué)監(jiān)測儀。儀器對零后2分鐘開始測定血壓，記錄1，2，3，4，5，6分鐘時的動脈平均壓。每只連測6次，取其平均值，其中4只因穿刺失敗死亡。 3、左室重/體重比(LVW/BW)的測定：大鼠處死后，迅速開胸取出心臟，用冰生理鹽水反復(fù)沖洗，去除大血管、右室及左右心房，用濾紙吸干水分，左心室(含室間隔)稱重為左室重量，測LVW/BW(mg/g)值來評價LVH的程度。

4、 4、運用實時熒光PCR技術(shù)測定各組大鼠的心肌組織中NHE-1 mRNA的拷貝數(shù)：4.1標本：選取左心室心肌一小塊放入1.5ml冷存管，然后直接投入-80度冰箱以備實驗時用。 4．2心肌組織總RNA的制備：采用異硫氰酸胍法，RNA含量及純度鑒定用紫外分光光度法檢測，1％甲醛凝膠變性電泳鑒定RNA完整性。 4．3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)獲得cDNA片段均取各心肌組織1.5μg總RNA進行cDNA合成(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照Rever

5、tAid HMinus First Strand cDNA Synthesis試劑盒說明)。 4．4熒光定量PCR引物設(shè)計：通過ABI公司提供的熒光定量PCR引物設(shè)計軟件Primer Express 2.0分別設(shè)計出的大鼠NHE-1和GAPDH的引物，所有引物由日本TaKaRa公司合成。引物序列如下：NHE-1Realtime PCR Primer，F(xiàn)orward：GGAAACAAGACGGGTGACCTAT，reverse：C

6、TGCAGCTCCGAGTAAGGA，TaqManprobeSequence：CACGGTTCTCCCACTAGCCTCGGTG：Rat GAPDH Real time PCR Primer，F(xiàn)orward：TGGTGCCAAAAGGG TCAT，REVERSE：TCACACCCATCACAAACATG，the TaqManprobe：Sequence：5-FAM-CCCCTTCCGCTGATGCCC-3’-TAMRA：用于制備GAPD

7、H和標準品的GAPDH普通引物，5‘-GGCAAGTTCAATGGCACAGT-3’，5‘-AAGGTGGAGG AATGGGAGTT-3’。 4．5熒光定量PCR標準品的制備取心肌組織樣品總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板應(yīng)用設(shè)計好的NHE-1的引物和GAPDH的普通引物對進行普通PCR擴增，反應(yīng)體系(參照日本TaKaRa 公司Faq<'TM>PCR Kit說明書設(shè)定)。4．6PCR產(chǎn)物凝膠回收回收的DNA在Epp

8、endorf光密度儀上測定含量，-20℃保存。 4．7T-載體連接參照日本TaKaRa公司pMD 18-T Vector產(chǎn)品說明書。 4．8質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌4．9質(zhì)粒DNA小量制備4．10標準品的絕對拷貝數(shù)的計算及梯度稀釋方案首先將150ng/μl：NHE-1和190ng/μl GAPDH重組質(zhì)粒稀釋成1×10<'10>copy/μl然后依次10倍稀釋得到10<'9>至10<'3>copy/μl的標準品備用。

9、 4．11熒光定量PCR反應(yīng)實時定量PCR參照TaqMan universal PCR Master Mix說明書操作，反應(yīng)條件：95℃，10min：然后95℃，15sec，58℃，30sec，72℃，30sec開始循環(huán)，共40 cycles，每個循環(huán)第2步結(jié)束后進行熒光的檢測。按上述反應(yīng)體系加樣，每個樣品做三個復(fù)孔，然后將樣品置于熒光定量儀上，根據(jù)設(shè)定好的程序進行反應(yīng)，運用Strategen Mx3000p軟件進行實時數(shù)據(jù)收集和定量

10、分析。 5、統(tǒng)計學(xué)分析：運用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以均數(shù)±標準差(x±s)表示，兩組大鼠體重、平均血壓、左心室重量及左室重量/體重之比和心肌組織中NHE-1 mRNA的表達的比較用t檢驗，大鼠平均血壓與左室重量的相關(guān)性、大鼠平均血壓與左室重量/體重之比、大鼠心肌組織中的NHE-1 mRNA基因拷貝數(shù)與左室重量/體重之比的相關(guān)性用pearson相關(guān)性分析，定p<0.05(雙側(cè))為統(tǒng)計學(xué)上差異。 結(jié)果：

11、 1、兩組大鼠平均血壓的比較自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)組平均血壓111.39±13.95mmHg，正常血壓大鼠(WKY)組平均血壓86.89±6.31 mmHg；兩組比較，采用t檢驗，t=6.783，P<0.000，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2、兩組大鼠體重的比較SHR組體重232.89±45.99g，WKY組體重219.79±23.39 g；兩組比較，采用t檢驗，t=1.078，P=0.291，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 3、兩組大鼠左

12、室重量及左室重/體重之比的比較SHR組左室重量0.58±0.18g，WKY組左室重量0.46±0.71g；兩組比較，采用t檢驗，t=2.702，P=0.013，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；SHR組左室重/體重之比2.46±0.38 mg/g，WKY組左室重/體重之比2.08±0.20 mg/g；兩組比較，采用t檢驗，t=3.671，P=0.001，差異顯著有統(tǒng)計學(xué)意義。 4、兩組大鼠心肌組織中NHE-1mRNA拷貝數(shù)的比較SHR組大鼠心肌

13、組織中NHE-lmRNA拷貝數(shù)(10.9±10.8)×10<'-2>cycle/ul，WKY組大鼠心肌組織中NHE-1mRNA拷貝數(shù)(2.7±4.1)×10<'-2>cycle/ul；兩組比較，采用t檢驗，t=3.005，P=0.007，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 5、大鼠平均血壓與左室重量的相關(guān)性所有實驗大鼠的平均血壓和左室重量的相關(guān)分析采用pearson相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r=0.700，p<0.000，兩者呈正相關(guān)。 6、

14、大鼠平均血壓與左室重/體重之比的相關(guān)性所有實驗大鼠的平均血壓和左室重/體重之比的相關(guān)分析采用pearson相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r=0.617，p<0.000，兩者呈正相關(guān)。 7、大鼠心肌組織中NHE-1mRNA拷貝數(shù)與左心室重量的相關(guān)性所有實驗大鼠的心肌組織中NHE-1mRNA拷貝數(shù)和左室重量的相關(guān)分析采用pearson相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r=0.374，p=0.025<0.05，兩者呈正相關(guān)。 8、大鼠心肌組織中NHE

15、一-mRNA拷貝數(shù)與左心室重量/體重之比的相關(guān)性所有實驗大鼠的心肌組織中NHE-1mRNA拷貝數(shù)和左心室重量/體重之比的相關(guān)分析采用pearson相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r=0.514，p=0.01，兩者呈正相關(guān)。 結(jié)論： 1、自發(fā)性高血壓大鼠組(SHR)與正常血壓大鼠組(WKY)相比，SHR組的LVW、LVW/Bw顯著高于WKY組，大鼠的平均血壓與左室重量、左室重/體重之比呈正相關(guān)，提示其心肌肥厚程度高于WKY組。