自發(fā)性高血壓大鼠致病基因群的初步篩選.pdf

1、目的：從13周齡的自發(fā)性高血壓大鼠(SpontaneouslyHypertensiveRats，SHR)和正常血壓大鼠(Wistar-Kyoto，WKY)的阻力血管(腸系膜動(dòng)脈第二、三級(jí)分支)和腎臟組織中提取總RNA，與含10,000個(gè)基因及EST片斷的SBC-R-RC-100-13大鼠表達(dá)芯片進(jìn)行雜交，找出差異表達(dá)的基因，并經(jīng)RT-PCR和real4imeRT-PCR初步篩選出高血壓新的相關(guān)基因。為進(jìn)一步了解高血壓病的分子機(jī)制提供新的

2、思路和線索。 方法：(1)取13周齡的雄性SHR和WKY各3只，分為SHR和WKY組。以O(shè)．5％戊巴比妥腹腔麻醉后，用MedLabV5．0生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄頸動(dòng)脈血壓后，取阻力血管(腸系膜動(dòng)脈第二、三級(jí)分支)和腎臟一70~C冷凍保存?zhèn)溆?，提取SHR和WKY的腸系膜動(dòng)脈和腎臟的總RNA。經(jīng)RNA電泳和分光光度計(jì)進(jìn)行總RNA的質(zhì)量鑒定后。將同組的3只大鼠的腸系膜動(dòng)脈和腎臟的總RNA等比例混合。逆轉(zhuǎn)錄法將Cy3-dUTP標(biāo)記SH

3、R組cDNA；Cy5-dUTP標(biāo)記WKY組cDNA，然后與含10,000個(gè)基因的SBC-R-RC-100-13大鼠表達(dá)芯片雜交，洗滌。AgilemG2655AA掃描芯片，用Genespring分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出在SHR表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的基因。(2)選取芯片篩選出在表達(dá)差異的6個(gè)基因，設(shè)計(jì)特異的PCR引物，用RT-PCR初步篩選排除假陽性。再設(shè)計(jì)特異的實(shí)時(shí)RT-PCR引物，并經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確保沒有雜帶等。用嵌合熒光法(SYBRGreenI)實(shí)時(shí)

4、RT-PCR進(jìn)一步證實(shí)陽性基因表達(dá)的mRNA水平。 結(jié)果：測血壓確實(shí)SHR組血壓(225±8vs168±6)mmHg明顯高于WKY組(88±6vs66±5)mmHg(P<0．01)。從兩組的芯片的結(jié)果分析中，初步獲得高血壓的相關(guān)基因120個(gè)，共同表現(xiàn)為上調(diào)的基因38條，下調(diào)的基因82條。按其作用和功能可以將這些基因歸類，包括涉及免疫，細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞調(diào)亡，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白和核轉(zhuǎn)錄因子，氧化應(yīng)激，直接參與代謝的酶，鈣結(jié)合蛋白，

5、EST等。選取6個(gè)基因，經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證的結(jié)果發(fā)現(xiàn)FXYD5基因和硬脂酰輔酶去飽和酶1(SCDl)在SHR中表達(dá)下調(diào)；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5(GFBP5)在SHR中表達(dá)上調(diào)。上述基因再經(jīng)real-timeRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)SCDl基因的表達(dá)水平在SHR組比WKY組下調(diào)1．63倍(P<0．05)；FXYD5基因表達(dá)下調(diào)15倍(P<0．01)，而GFBP5及內(nèi)參照GAPDH在兩組無顯著差異(P>0．05)。 結(jié)論：基因芯片的