腎血管性及自發(fā)性高血壓大鼠左心室肥厚的比較蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、 第一部分.腎血管性及自發(fā)性高血壓大鼠左心室肥厚的比較 目的：左心室肥厚是心肌工作超負荷的一種適應性反應，是引起心血管疾病發(fā)生率和死亡率顯著升高的獨立危險因素。腎血管性高血壓和自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneouslyhypertensiverats，SHR)均可發(fā)生左心室肥厚，然而，引起二者左心室肥厚的分子機制是否相同目前尚不清楚。因此，本實驗采用上述兩種模型，比較二者左心室肥厚的異同。 方法：采用兩腎兩夾法(

2、twokidneytwoclip，2K2C)建立腎血管性高血壓大鼠模型。術(shù)后4周篩選出符合要求的大鼠，隨機分為3組，各8只：第一組作為兩腎兩夾4周組；第二組作為兩腎兩夾8周組，繼續(xù)喂養(yǎng)4周；第三組作為兩腎兩夾12周組，繼續(xù)喂養(yǎng)8周。并同時設立相應假手術(shù)對照組：第四組作為對照4周組；第五組作為對照8周組；第六組作為對照12周組。同時，周齡匹配的SHR分為3組：第七組作為SHR8周齡組；第八組作為SHR12周齡組；第九組作為SHR16周齡組

3、。實驗結(jié)束時，行超聲心動圖檢查后，左心室插管檢測血流動力學指標，處死大鼠，留取左心室標本并稱重，計算左室重量指數(shù)，HE染色觀察心肌超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果： 1.各組大鼠手術(shù)前基礎(chǔ)血壓約110mmHg，兩腎兩夾術(shù)后兩周，血壓上升至147±9mmHg，術(shù)后四周血壓高于170mmHg，此后血壓繼續(xù)升高，于術(shù)后六周達峰值(218±14mmHg)，并維持至術(shù)后12周。同時，SHR組大鼠隨年齡增長血壓呈進行性升高，均顯著高于周齡匹配的對照

4、大鼠。 2.與對照組相比，各組2K2C大鼠及SHR心臟體積明顯增大，左心室重量增加，左室重量指數(shù)(LVW/BW)明顯增高，差異具有顯著性。 3.與對照組相比，手術(shù)后4周的2K2C大鼠及不同周齡的SHR，其室間隔及左室后壁厚度均明顯增加，同時，左室內(nèi)徑顯著減小，呈現(xiàn)出明顯的向心性肥厚。而手術(shù)后8周及12周的2K2C大鼠，其室間隔及左室后壁厚度均較假手術(shù)組明顯減小，左室內(nèi)徑顯著增大，呈明顯的離心性肥厚。 4.手術(shù)后8

5、周、12周的2K2C大鼠以及16周齡的SHR，其EF、FS、±dp/dtmax均較對照組相比顯著降低，LVEDP以及T值明顯升高。 結(jié)論：兩腎兩夾高血壓大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠都發(fā)生了相同程度的左心室肥厚，且隨時間延長，心功能都不同程度的下降。但是二者的肥厚表型不同：兩腎兩夾高血壓大鼠呈明顯的離心性肥厚，而自發(fā)性高血壓大鼠呈明顯的向心性肥厚。 第二部分.腎血管性及自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織的比較蛋白質(zhì)組學研究 目的：

6、采用腎血管性及自發(fā)性高血壓大鼠左心室肥厚模型，運用蛋白質(zhì)組學技術(shù)，尋找腎血管性高血壓、自發(fā)性高血壓與血壓正常大鼠間心肌的差異表達蛋白質(zhì)，并對這些差異表達蛋白分子進行鑒定，為新藥設計提供一些新思路。 方法：來自于兩腎兩夾術(shù)后12周、對照12周以及16周齡自發(fā)性高血壓大鼠左心室的12個蛋白質(zhì)樣品(n=4)，分別用熒光染料Cy3、Cy5標記，以及12個樣品等量混合物用Cy2標記作為內(nèi)標，每一Cy3、Cy5標記樣品與Cy2標記的內(nèi)標等量

7、混合后在同一塊膠中進行電泳分離，經(jīng)不同光激發(fā)后掃描得到不同樣品的蛋白質(zhì)組圖譜，經(jīng)DeCyder圖像分析軟件分析，尋找三組間的差異蛋白。并運用MALDI-TOF-TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀對差異蛋白質(zhì)進行鑒定。同時運用Westernblot以及RT-PCR對差異蛋白質(zhì)進行進一步驗證。 結(jié)果：經(jīng)DeCyder圖像分析軟件分析，以相差2倍以上的蛋白作為差異蛋白質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：2K2C組相對于對照組有19個差異蛋白點，其中3個蛋白表達上調(diào)，16個蛋

8、白表達下調(diào)；SHR組相對于對照組有23個差異蛋白點，其中6個蛋白表達上調(diào)，17個蛋白表達下調(diào)；2K2C組和SHR組之間有20個差異蛋白點，其中9個蛋白表達上調(diào)，11個蛋白表達下調(diào)。運用質(zhì)譜技術(shù)鑒定出5個差異蛋白，它們分別為：α-烯醇化酶、短鏈脂酰輔酶A脫氫酶、NADH脫氫酶α亞復合體10、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶，mu2以及β-肌球蛋白重鏈。其中，與2K2C組相比，SHR組α-烯醇化酶表達上調(diào)；短鏈脂酰輔酶A脫氫酶和谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶，m

9、u2在SHR組顯著降低，而在2K2C組無明顯變化；NADH脫氫酶α亞復合體10在2K2C和SHR組中均明顯下調(diào)；而β-肌球蛋白重鏈在兩種模型中的表達均上調(diào)。同時，分別對這5個差異蛋白采用Westernblot以及RT-PCR方法進行了驗證，結(jié)果與2-DE的趨勢基本一致。 結(jié)論：兩腎兩夾高血壓、自發(fā)性高血壓以及血壓正常大鼠間心肌蛋白質(zhì)組存在差異；α-烯醇化酶、NADH脫氫酶1α亞復合體10、短鏈脂酰輔酶A脫氫酶和谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移

10、酶，mu2可能參與了高血壓性左心室肥厚；同時，短鏈脂酰輔酶A脫氫酶和谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶，mu2可能作為自發(fā)性高血壓大鼠左心室肥厚相關(guān)的候選蛋白。 第三部分.依那普利對腎血管性及自發(fā)性高血壓大鼠相關(guān)差異蛋白質(zhì)表達的影響 目的：觀察依那普利對腎血管性及自發(fā)性高血壓大鼠相關(guān)差異蛋白質(zhì)表達的影響，以觀察差異蛋白質(zhì)在兩種模型中的作用。 方法：建立兩腎兩夾高血壓大鼠模型，對照組和2K2C組于手術(shù)后4周開始給藥；7周齡自發(fā)性

11、高血壓大鼠正常飼養(yǎng)1周后開始給藥。實驗共分5組：(1)對照組：以等量0.5％羧甲基纖維素鈉灌胃；(2)2K2C組：以等量0.5％羧甲基纖維素鈉灌胃；(3)2K2C+依那普利組：依那普利10mg/kg/d；(4)SHR組：以等量0.5％羧甲基纖維素鈉灌胃；(5)SHR+依那普利組：依那普利10mg/kg/d。各組均灌胃8周，每周測體重，按體重調(diào)整用藥。實驗結(jié)束時，行超聲心動圖檢查后，左心室插管檢測血流動力學指標，處死大鼠，留取左室標本并稱

12、重，計算左室重量指數(shù)，HE染色觀察心肌超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果： 1.2K2C及SHR組血壓及左室重量指數(shù)均顯著高于對照組，給予依那普利后的2K2C及SHR組，其血壓及左室重量指數(shù)均明顯下降，具有顯著性差異。 2.與對照組相比，2K2C大鼠室間隔及左室后壁厚度均明顯減小，左室內(nèi)徑顯著增大，呈明顯的離心性肥厚。而SHR組室間隔及左室后壁厚度均明顯增加，同時，左室內(nèi)徑顯著減小，呈現(xiàn)出明顯的向心性肥厚。2K2C組給予依那普利后

13、，室間隔及左室后壁厚度均顯著增加，左室內(nèi)徑明顯減?。欢鳶HR組給予依那普利后，室間隔及左室后壁厚度均顯著減小，左室內(nèi)徑明顯增大，與相應模型組比較，均具有顯著性差異。 3.2K2C和SHR組EF、FS及±dp/dtmax顯著下降，LVEDP和T值均顯著升高。而依那普利治療后的2K2C及SHR組EF、FS及±dp/dtmax明顯上升，LVEDP和T值均明顯下降，兩組大鼠心功能均得到明顯改善。 4.與2K2C組相比，α-烯醇化

14、酶在SHR組中的表達明顯上調(diào)，而依那普利治療后的SHR組，α-烯醇化酶的表達與相應模型組相比無明顯差異；短鏈脂酰輔酶A脫氫酶和谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶，mu2在SHR組顯著降低，而2K2C組無明顯變化，經(jīng)依那普利治療后，二者的表達變化未得到明顯逆轉(zhuǎn)；NADH脫氫酶α亞復合體10在2K2C和SHR組中均明顯下調(diào)，依那普利治療后，未改變其在兩種模型中的變化；β-肌球蛋白重鏈在2K2C和SHR組中的表達均上調(diào)，而依那普利治療后，β-肌球蛋白重鏈在