補腎法對酒精干預(yù)成骨樣細胞蛋白質(zhì)表達影響的實驗及相關(guān)臨床研究.pdf

1、1 研究目的: 股骨頭壞死 (osteonecrosis of the femoral hlead，ONFH)是由于多種病因破壞股骨頭血供使骨的活性成分死亡的一種病理過程。酒精性股骨頭壞死是常見的類型之一，目前病機認識方面比較膚淺，治療也處于被動，往往出現(xiàn)壞死后才進行治療，而且辦法不多，其發(fā)病機理和防治技術(shù)尚需不斷研究，尤其對其病機和中醫(yī)防治機理方面進行研究更具有重要意義。 過度攝入酒精是酒精性股骨頭的主要原因，目前發(fā)病

2、機理主要有酒精的細胞毒作用、骨細胞脂肪變性壞死等學(xué)說。股骨壞死的基本病理變化是骨小梁表面成排的成骨細胞消失，骨細胞陷窩空虛?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對股骨頭壞死的防治尚缺乏理想手段。“’腎主骨”是中醫(yī)治療骨病的理論依據(jù)，股骨頭壞死是中醫(yī)骨病中越來越受注目的一種，補腎法治療酒精性股骨頭壞死已經(jīng)在臨床上廣泛應(yīng)用，但是中醫(yī)方劑的治療作用機理一直未得到現(xiàn)代科學(xué)的合理闡述，不利于中醫(yī)現(xiàn)代化的發(fā)展。 蛋白質(zhì)組學(xué)是研究蛋白質(zhì)組的一個新領(lǐng)域，主要研究蛋白質(zhì)的特

3、性，可以在蛋白質(zhì)水平上了解細胞的各項功能、各種生理生化過程以及疾病的病理過程等，通過比較患病細胞與正常細胞中蛋白質(zhì)的表達變化，或者比較患病細胞與藥物處理后細胞中蛋白質(zhì)的表達變化，可能找到疾病的發(fā)病機制，同時也可能發(fā)現(xiàn)一些新的藥物靶點及新藥物。蛋白組學(xué)對中醫(yī)領(lǐng)域的辨證論治研究提供了全新概念的技術(shù)平臺，從現(xiàn)代技術(shù)講，補腎、補髓是有其基因?qū)W或蛋白質(zhì)學(xué)的依據(jù)的。 目前在股骨頭壞死的機理和中藥治療的機制研究中進行體外模擬成骨細胞受損并進行

4、治療的實驗研究尚未見報道。本課題進行體外細胞實驗，首先模擬酒精性股骨頭壞死細胞受損的模型，然后采用補腎法代表方劑六味地黃丸含藥血清進行治療，再用蛋白組學(xué)的雙向電泳技術(shù)，找出酒精干預(yù)和治療后的差異蛋白質(zhì)點，并進行初步分析，為進一步發(fā)現(xiàn)差異蛋白質(zhì)進而研究酒精性股骨頭壞死的發(fā)病機理和補腎法的治療機制打下基礎(chǔ)。 2 研究方法與結(jié)果: 2.1 補腎法對OS-732 成骨樣細胞增殖作用的研究 2.1.1 細胞生長曲線繪制.

5、 選擇合適密度的OS-732成骨樣細胞，給以血清濃度為10％的六味地黃丸高、中、低劑量組和空白對照組(即生理鹽水灌胃)血清連續(xù)培養(yǎng)7天。顯微鏡觀察并計數(shù)，繪制細胞生長曲線，發(fā)現(xiàn)藥物組的增殖作用均較空白血清組強，高、中劑量組含藥血清對細胞有較強的刺激作用，而又以中劑量組的作用最強，3—6d為對數(shù)生長期。 2.1.2 MTT法測定OS-732成骨樣細胞的增殖. 試驗選擇合適密度的OS-732成骨樣細胞，給以血清濃度為1

6、0％的六味地黃丸高、中、低劑量組和生理鹽水空白對照組血清進行連續(xù)培養(yǎng)5天，每天酶標儀測定吸光值，結(jié)果：培養(yǎng)24h、48h未見明顯差異，但培養(yǎng)第3d、4d、5d后，高、中、低劑量組的增殖作用均較生理鹽水空白對照組強，又以中劑量組最為明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義，高、低劑量組無統(tǒng)計學(xué)意義2.1.3 OS-732成骨樣細胞分泌ALP的實驗研究選擇合適密度的OS-732成骨樣細胞，給以血清濃度為10％的六味地黃丸高、中、低劑量組和生理鹽水空白對照組血清

7、進行培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)第3d、4d、5d后進行堿性磷酸酶試劑盒檢測，酶標儀測定OD值結(jié)果：高、中、低各劑量組均比生理鹽水空白組高，但以中劑量組最為明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義。高、低劑量組無統(tǒng)計學(xué)意義。 2.2 OS-732成骨樣細胞酒精干預(yù)和六味地黃丸含藥血清治療作用的實驗研究 2.2.1 OS-732成骨樣細胞不同濃度酒精干預(yù)下細胞凋亡率檢測 選擇生長良好合適密度的OS-732成骨樣細胞，分別加入不同濃度的酒精進行孵育

8、，空白對照組僅加入同等量RPM11640。分別于干預(yù)后的第24h、48h與72h收集細胞，冷乙醇固定、PI液染、流式細胞儀檢測。 結(jié)果：酒精干預(yù)各組細胞凋亡率明顯比空白對照組增高，具有顯著意義(p<0.05)，隨著酒精濃度的增加，干預(yù)時間的延長，凋亡率逐漸升高，凋亡率與酒精濃度呈正相關(guān)，與干預(yù)的時間成正相關(guān)。 2.2.2 OS-732成骨樣細胞酒精干預(yù)后 電子顯微鏡觀察分為正常OS-732成骨樣細胞組，酒精干預(yù)組

9、，酒精干預(yù)后加六味地黃丸含藥血清治療組。 透射電鏡下的表現(xiàn)：正常成骨樣細胞核較大，呈多型性，核仁明顯，細胞質(zhì)中可見較多的核糖體、高爾基體及溶酶體樣顆粒。給予酒精干預(yù)后部分細胞器發(fā)生變化，核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，出現(xiàn)較多空泡，可以見到典型的細胞凋亡表現(xiàn)，細胞核固縮碎裂。藥物治療后細胞質(zhì)內(nèi)的細胞器從結(jié)構(gòu)上有所恢復(fù)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體清晰可見。 2.3 OS-732成骨樣細胞酒精干預(yù)和六味地黃丸含藥血清治療后差異蛋白表達的初步分析

10、 成骨樣細胞分為酒精干預(yù)組、藥物治療組、空白對照組。每組細胞提取總蛋白后進行雙向凝膠電泳技術(shù)分離，得出蛋白質(zhì)點電泳凝膠圖譜，然后進行計算機圖像分析軟件分析。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)酒精干預(yù)組與空白正常組相比，表現(xiàn)明顯差異的蛋白點有5個(即 SSP1002、SSPl401、SSPl602、SSP8501、SSP8504)，均表現(xiàn)為表達降低。這5個蛋白在藥物組中其表達差異得到不同程度的逆轉(zhuǎn)。 2.4 補腎法治療酒精性股骨頭壞死的臨床研究

11、 以六味地黃丸合并生脈成骨片與單一生脈成骨片進行療效比較。 對69例酒精性股骨頭壞死患者進行系統(tǒng)的臨床觀察。結(jié)果表明，兩組均有較高療效，合并用藥組有效率83.78％，單一用藥組81.25％，兩組比較無顯著差異。從緩解疼痛指標看，合并用藥組優(yōu)于單一用藥組，具有顯著差異性(P=0.0028)；從治療前后的體征改善方面觀察，合并用藥明顯優(yōu)于單純用藥組(p<0.05)。在影像學(xué)方面，兩組的死骨吸收，新骨形成，骨膜反應(yīng)等方面沒有明顯差

12、異。 3 結(jié)論: 3.1 六味地黃丸含藥血清對OS-732成骨樣細胞具有增殖作用，促進細胞分泌ALP。 3.2 一定濃度的酒精可以引起OS-732成骨樣細胞凋亡，細胞凋亡與酒精濃度和干預(yù)時間成正相關(guān)。從倒置顯微鏡、透射電子顯微鏡不同角度觀察到細胞受損的表現(xiàn)，可以見到細胞死亡和凋亡，存活的細胞可見空泡樣改變。 3.3 采用蛋白組學(xué)雙向電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)酒精干預(yù)后受損的OS-732 成骨樣細胞部分蛋白質(zhì)表達下調(diào)，中