輻射致癌相關蛋白質篩選及其表達研究.pdf

1、研究內容和方法： 建立輻射致癌細胞模型：選取SV40病毒轉染的永生化的人支氣管上皮細胞株(BEAS-2B)，利用γ射線分3次進行照射誘導癌變，總劑量22Gy。細胞惡性程度利用裸鼠致瘤實驗進行鑒定。 篩選輻射致癌差異蛋白表達譜：利用2-D凝膠電泳技術對正常BEAS-2B細胞和輻射誘導癌變細胞的總蛋白進行電泳分離。ImageMasterPlatinum5.0圖形分析軟件對凝膠圖譜進行分析，篩選出正常細胞與癌變細胞間的差異蛋白

2、質點。選取部分差異表達蛋白點，利用MALDI-TOFMS對蛋白點進行肽指紋譜(PMF)鑒定。 部分蛋白在輻射致癌不同階段的表達變化情況：從正常細胞與癌變細胞差異表達蛋白譜中選取ENO1、GPXl、Dyrk2PrxⅠ作為代表，利用WesternBlot技術觀察它們在輻射急性期、輻射致癌早期、輻射致癌中期和輻射致癌晚期蛋白表達量的變化。利用熒光定量PCR技術觀察4種蛋白在輻射急性期、輻射致癌早期、中期和晚期mRNA拷貝數(shù)的變化情況，

3、結合WersternBlot的結果，對這4種蛋白在輻射致癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用進行推測和討論。 實驗結果：裸鼠致瘤實驗是判斷細胞是否發(fā)生惡性轉化的最終判斷標準。分別取處于對數(shù)增殖期的BR22P35、BR22P45、BR22P50、BR22P60及正常對照組細胞注入到裸鼠頸背部皮膚，細胞注射量為1×107個，結果種植BR22P35和BR22P45細胞的裸鼠直到自然死亡也未觀察到腫瘤的形成(分別為6只、8只)。而在種植BR22P5

4、0細胞的8只裸鼠中，經(jīng)過50天的潛伏期后觀察到1只裸鼠的頸背部形成腫瘤。種植BR22P60細胞的8只裸鼠中，有4只裸鼠在注射1-2個月后觀察到腫瘤出現(xiàn)，其中1只裸鼠在腫瘤形成4周左右死亡。四只成瘤裸鼠的瘤體緩慢長大，表現(xiàn)了惡性表形的發(fā)展特點。經(jīng)病理切片證實為中度惡性支氣管鱗狀上皮細胞轉移癌。證明該細胞株已發(fā)生癌變，可作為后續(xù)實驗細胞模型使用。 雙向凝膠電泳分析正常BEAS-2B細胞和誘導癌變BEAS-2B細胞差異表達蛋白，正常組

5、細胞凝膠共得到1102±29個蛋白點，誘導癌變組細胞共得到1058±33個蛋白點，電泳結果重復性良好，所有凝膠圖譜的蛋白質點分布模式非常相似。癌變組與正常組比較，共得到877個匹配蛋白點，癌變組與正常組的點匹配率分別為79.58％和82.89％。 熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)：(1)ENO1的mRNA拷貝數(shù)在輻射癌變組、輻射癌變中期、輻射癌變早期、輻射急性期和正常組細胞中逐漸下降，除去正常細胞和輻射急性期細胞間及輻射急性期細胞和輻射癌

6、變早期細胞間無明顯差異(P＞0.05)外，其余各組之間存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；其中輻射癌變組細胞與除輻射癌變中期組細胞外的各組細胞間差異明顯(P＜0.01)。(2)PrxⅠ的mRNA拷貝數(shù)在輻射癌變組和輻射癌變中期細胞間無顯著差異(P＞0.05)；輻射急性期細胞內PrxⅠ的mRNA拷貝數(shù)高于正常組細胞(P＜0.05)；其余各組間差異顯著(P＜0.01)，且隨著輻射劑量的增加和照后時間的延長而增加，其拷貝數(shù)在正常細胞中最少，輻射癌

7、變組和輻射中癌變期細胞中拷貝數(shù)最高。(3)Dyrk2的mRNA拷貝數(shù)除輻射癌變組和輻射癌變中期細胞間無顯著差異外(P＞0.05)，其余各組間均存在顯著差異(P＜0.01)，且隨著輻射劑量的增加和照后時間的延長而減少，其拷貝數(shù)在正常細胞中最多，輻射癌變組和輻射中癌變期細胞中拷貝數(shù)最少。其中正常細胞和輻射急性期細胞內的mRNA拷貝數(shù)與輻射癌變各期細胞之間差異變化較大。(4)GPX1的mRNA拷貝數(shù)在正常組、輻射急性期、輻射癌變早期、輻射癌變

8、中期和輻射癌變組細胞中逐漸降低，除去輻射癌變組細胞與癌變中期細胞間無明顯差異(P＞0.05)外，其余各組之間存在顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。 討論：ENO1是參與糖酵解過程的一種催化酶，其主要催化2-磷酸甘油酸向磷酸烯醇丙酮酸的轉化。近期對ENO1在腫瘤中作用的研究結果比較矛盾，有研究表明ENO1及其同基因表達產(chǎn)物MBP-1可以負向調控c-myc的表達，對腫瘤的發(fā)生有抑制作用，外源性引入ENO1序列可引起成神經(jīng)細胞瘤發(fā)生凋亡

9、。在部分腫瘤中ENO1的表達降低，與其腫瘤抑制功能的預測相符。但又有部分研究結果與其相反，RaczA等研究發(fā)現(xiàn)在人鱗狀上皮細胞肺癌中ENO1基因擴增明顯增高，ZhangD等觀察發(fā)現(xiàn)ENO1蛋白的表達量在乳腺癌細胞中表達升高。本課題實驗發(fā)現(xiàn)，無論是在蛋白水平還是在mRNA水平，輻射癌變細胞中的ENO1表達量均明顯升高，與RaczA等的觀察結果相同。同時本課題的熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)ENO1的mRNA表達量在輻射急性期和輻射致癌早期時升高并不顯

10、著，而到輻射致癌中期時明顯升高，提示ENO1并未參與細胞的初期轉化過程，而細胞在癌變中期時已逐步向惡性方向轉化，增殖分裂加快，能量消耗增加，引起糖酵解過程逐步加強，這在一定程度上導致ENO1的高表達。另外輻射誘導癌變的人支氣管上皮細胞并未因ENO1蛋白的高表達而發(fā)生凋亡，加之上述研究結果提示ENO1的腫瘤抑制作用是由于對c-myc的負調控作用而實現(xiàn)的，因此考慮輻射誘導人支氣管上皮細胞癌變的過程可能沒有c-myc基因的參與。 Pr

11、xⅠ是一種過氧化物酶，屬于Peroxiredoxin抗氧化蛋白家族。PrxⅠ的抗氧化與自由基清除作用主要通過硫氧還蛋白還原過氧化物或超氧化物，在消除代謝產(chǎn)生的過氧化物中具有重要作用。另外，該蛋白還與細胞增殖密切相關，可以促進多種細胞的增殖與分化。在輻射生物效應和癌癥方面，有研究表明PrxⅠ是一個可誘導的蛋白，在輻射引起的氧化應激條件下其表達顯著增高，并且其表達水平與輻射的劑量和照射后時間呈正相關，另有研究發(fā)現(xiàn)PrxⅠ高表達于一些惡性腫瘤

12、細胞中，包括肺癌、乳腺癌、肝癌等，本課題的實驗結果與上訴研究結果相符，因此PrxⅠ的升高在一定程度上可能是由于輻射導致細胞內超氧化合物增多，間接引起PrxⅠ的表達升高。另有研究發(fā)現(xiàn)轉染外源性的PrxⅠ可增加腫瘤細胞對順鉑誘導凋亡作用的抗性，增加腫瘤細胞的存活率；ChenMF等研究發(fā)現(xiàn)，抑制PrxⅠ在肺癌細胞中的表達導致肺癌細胞增殖緩慢且對輻射抗性降低，因此提示PrxⅠ可能在促進腫瘤細胞的增殖、發(fā)展以及提高腫瘤細胞輻射抗性方面方面起重要作

13、用。 Dyrk2是Dyrk蛋白家族)的一個成員。該蛋白激酶家族對蛋白質絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸片斷均具有磷酸化活性。目前，該蛋白家族的細胞功能仍不十分清楚。有研究發(fā)現(xiàn)在肺及胃腸道的腺癌細胞中Dyrk2的蛋白和mRNA表達量均明顯升高，ParkGH等發(fā)現(xiàn)利用抗癌劑8-Cl-cAMP處理成神經(jīng)瘤細胞后導致Dyrk2的mRNA表達量下降，提示Dyrk2可能在腫瘤的發(fā)生和增殖中起重要作用。但是本課題的研究發(fā)現(xiàn)在輻射誘導癌變的人支氣管上皮細

14、胞中Dyrk2的表達量卻明顯下降，與上述研究的結果完全相反，經(jīng)檢索也未發(fā)現(xiàn)與本研究相一致的結果報告。我們認為可能有以下幾種原因：首先，上述幾項研究主要在腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)Dyrk2的表達升高，而本課題觀察的是鱗狀上皮細胞癌，Dyrk2是否存在組織表達特異性的可能目前尚不清楚。其次，上述研究并未引入輻射處理因素，Dyrk2的表達降低可能為輻射因素誘導的結果，但目前尚無相關文獻支持，有待于進一步證實。再次，輻射效應和腫瘤的發(fā)生過程是一個多基因參

15、與的復雜的信號網(wǎng)絡調控過程，有諸多的細胞信號通路與腫瘤的發(fā)生有關，本課題中輻射誘導人支氣管上皮細胞癌變的過程可能并沒有Dyrk2所介導的信號通路參與，而同時由于細胞信號的網(wǎng)絡化調控，細胞在癌變過程中對其余信號通路產(chǎn)生了負向調控作用，間接導致Dyrk2的表達量下降?？傊捎诎┌Y發(fā)生及發(fā)展過程的高度復雜性，我們無法對很多基因的表達情況作出準確的預測，對矛盾結果的深入研究可能更加有助于我們對癌癥發(fā)生機理的理解。 GPX1是一種含硒抗

16、氧化物酶，在細胞中的主要作用是通過還原性谷胱甘肽催化還原過氧化物和有機過氧化氫物，從而保護細胞和其它如DNA，蛋白及脂質體等敏感生物分子免受氧自由基的損傷。近期研究發(fā)現(xiàn)硒元素可以降低很多腫瘤的發(fā)生率，有臨床觀察發(fā)現(xiàn)體內硒元素的水平與結腸癌的發(fā)病率呈顯著負相關，臨床補充硒元素可降低結直腸癌的發(fā)病率和死亡率。 通過本課題，我們成功建立了輻射致癌的細胞模型，利用二維凝膠電泳和生物質譜技術得到輻射致癌的蛋白表達改變譜，并對其中4個蛋白(

17、ENO1、PrxⅠ、Dyrk2和GPX1)在輻射致癌不同階段的表達情況進行了分析。經(jīng)過對實驗結果的分析，我們認為：ENO1可能并未參與細胞的初期轉化過程，其升高可能是由于細胞惡變過程中糖酵解加強所引起；PrxⅠ可能在促進腫瘤細胞的增殖、發(fā)展以及提高腫瘤細胞輻射抗性方面起重要作用；Dyrk2的結果與其它研究者的結果截然相反，我們考慮Dyrk2可能存在組織表達特異性或者其表達降低是由輻射因素所引起；GPX1的降低可能與輻射誘導癌變的啟動密切