補(bǔ)腎法對激素干預(yù)成骨樣細(xì)胞作用的差異蛋白初步分析及相關(guān)研究.pdf

1、1 研究目的: 激素引起的股骨頭壞死已為人們所熟知。隨著激素的廣泛應(yīng)用，其發(fā)病率呈逐年增加趨勢，已占非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的首位。因此，對 SANFH 的發(fā)病機(jī)理及治療方法機(jī)理的研究很有必要。 SANFH的確切的發(fā)病機(jī)理目前尚不清楚，普遍接受的觀點(diǎn)有如下學(xué)說：脂肪栓塞學(xué)說、骨細(xì)胞脂肪變性學(xué)說、骨內(nèi)高壓及靜脈淤滯學(xué)說、微血管帶損傷和骨質(zhì)疏松等學(xué)說。這些學(xué)說都不足以說明其發(fā)病機(jī)制。目前在蛋白分子水平的研究尚未見報(bào)道。 蛋

2、白質(zhì)組學(xué)是后基因組時(shí)代的一門新興學(xué)科。差異蛋白質(zhì)研究的重心在于尋找某種特定因素引起的細(xì)胞或組織樣本之間的蛋白質(zhì)組差異，揭示其在生理或病理過程中的變化，探察細(xì)胞或機(jī)體對環(huán)境刺激的反應(yīng)及細(xì)胞調(diào)控的機(jī)制，同時(shí)對某些標(biāo)志性蛋白進(jìn)行定性和功能分析。一旦能夠獲得蛋白質(zhì)組差異的足夠信息，從理論上來說就可以推斷造成這種變化的原因。本研究試圖從激素對成骨細(xì)胞的影響中找出差異蛋白，從而闡明SANFH的發(fā)病機(jī)理。這在理論上是一個(gè)突破，也為SANFH的治療提供

3、理論指導(dǎo)。 長期或大量使用糖皮質(zhì)激素，血液受熱煎熬而粘滯，運(yùn)行不暢，或灼傷脈絡(luò)血溢脈外留于股骨頭局部而成瘀痹，或熱舍于腎，內(nèi)伐腎精，均可致骨缺血性壞死。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為 SANFH 以“腎虛”、“血瘀”為主。因此，本研究根據(jù)中醫(yī)“腎主骨”的理論，運(yùn)用補(bǔ)腎的代表方六味地黃丸含藥血清對激素作用下成骨樣細(xì)胞的影響，從差異蛋白方面入手，闡明 SANFH 的發(fā)病機(jī)理和補(bǔ)腎法治療SANFH的機(jī)理。 2 研究方法: 2.1 實(shí)驗(yàn)

4、研究 2.1.1 六味地黃丸含藥血清對OS-732細(xì)胞增殖和分化的影響 目的:觀察補(bǔ)腎中藥對成骨樣細(xì)胞增殖分化的影響。 方法:制備低、中、高劑量的六味地黃丸含藥血清。10％低、中、高劑量的六味地黃丸含藥血清培養(yǎng)OS-732 細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況；細(xì)胞計(jì)數(shù)和繪制生長曲線；MTT 法檢測細(xì)胞增殖；進(jìn)行細(xì)胞堿性磷酸酶 (ALP)活性測定。 結(jié)果:含藥血清組細(xì)胞生長良好，中劑量組與對照組相比P<0.05

5、，統(tǒng)計(jì)學(xué)有明顯差異；在細(xì)胞增殖和細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性測定方面，中劑量組與對照組相比P<0.05，統(tǒng)計(jì)學(xué)有明顯差異。 結(jié)論:合適劑量的補(bǔ)腎中藥對成骨樣細(xì)胞的增殖和分化有明顯的促進(jìn)作用。 2.1.2不同濃度DMX對OS-732細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響 目的:通過不同濃度DMX體外培養(yǎng)，分析糖皮質(zhì)激素對成骨樣細(xì)胞凋亡和周期的影響。 方法:加入低、中、高濃度DMX培養(yǎng)OS-732細(xì)胞，于24th 和 48

6、h 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行流式細(xì)胞儀 (FCM)檢測細(xì)胞凋亡，分析細(xì)胞周期。 結(jié)果:24h 低濃度DMX導(dǎo)致細(xì)胞G<,2>+M期明顯增加，與對照組相比 P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；中濃度在各期與對照組無明顯差異；高濃度DMX對G0/G1期有阻滯作用，與對照組相比P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對照組和DMX組均出現(xiàn)了凋亡峰，低濃度和中濃度DMX 與對照組相比，細(xì)胞凋亡率無明顯差異；而高濃度組細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)。48h對

7、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期無明顯變化。 結(jié)論:糖皮質(zhì)激素使用的時(shí)間和量對成骨樣細(xì)胞的作用明顯不同，說明小劑量糖皮質(zhì)激素(生理需要量)對成骨樣細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，高劑量糖皮質(zhì)激素 (超過生理需要量)對成骨樣細(xì)胞的增殖和分化有抑制作用。 2.1.3 補(bǔ)腎法對激素干預(yù)成骨樣細(xì)胞作用的電鏡觀察 目的:觀察激素組和中藥治療組與對照組相比較，成骨樣細(xì)胞形態(tài)上的改變，了解其組織學(xué)上的差異。 方法:對照組、激素造模組和中藥治療

8、組培養(yǎng)OS-732細(xì)胞，收集細(xì)胞后固定、染色，電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。 結(jié)果:激素組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，形態(tài)不規(guī)則，線粒體減少，空泡增多；中藥治療組細(xì)胞形態(tài)明顯改善，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯增多。 結(jié)論:糖皮質(zhì)激素作用可以使成骨樣細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響細(xì)胞的成骨功能；補(bǔ)腎中藥可以改善成骨樣細(xì)胞的形態(tài)，從而減少成骨樣細(xì)胞凋亡。 2.1.4 補(bǔ)腎法對激素干預(yù)成骨樣細(xì)胞作用的差異蛋白初步分析 目的:比較激素組和中藥治療

9、組與對照組雙向電泳圖譜上蛋白點(diǎn)的差異，分析激素引起成骨樣細(xì)胞凋亡的蛋白表達(dá)和補(bǔ)腎中藥對凋亡細(xì)胞作用的蛋白表達(dá)變化。 方法:提取對照組、激素模型組和中藥治療組培養(yǎng)OS-732 細(xì)胞的總蛋白，雙向電泳，對差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行分析。 結(jié)果:激素組有7個(gè)蛋白表達(dá)下降，其中，SSP1005、SSP2301、SSP3202和SSP6501四個(gè)點(diǎn)最為明顯，SSP5604 點(diǎn)蛋白不發(fā)生表達(dá)；中藥治療組對上述7個(gè)點(diǎn)的表達(dá)均有不同程度的增強(qiáng)，SS

10、P5604 點(diǎn)明顯增強(qiáng)。 結(jié)論:糖皮質(zhì)激素作用可以使成骨樣細(xì)胞某些蛋白表達(dá)減弱，從而造成成骨樣細(xì)胞凋亡；補(bǔ)腎中藥可以使某些蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。 綜上所述，補(bǔ)腎中藥可以促進(jìn)成骨樣細(xì)胞的增殖和分化，改善成骨樣細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)；抑制糖皮質(zhì)激素引起的成骨樣細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)因糖皮質(zhì)激素引起的成骨樣細(xì)胞凋亡所致的某些蛋白的表達(dá)。 2.2 臨床研究 目的:觀察補(bǔ)腎中藥治療SANFH 的臨床療效。 方法:66例病人分為

11、兩組，對照組給予生脈成骨片，合并用藥組給予生脈成骨片加六味地黃丸。從疼痛、功能、關(guān)節(jié)活動度及X線評價(jià)四個(gè)方面對兩組進(jìn)行觀察比較。 結(jié)果:兩組治療前后總的療效均有顯著性差異。但合并用藥組在緩解疼痛、改善關(guān)節(jié)活動度和關(guān)節(jié)功能方面明顯優(yōu)于對照組，而在X線評價(jià)無明顯差異。 結(jié)論:補(bǔ)腎法是治療SANFH 兩大治法之一，在活血通絡(luò)的同時(shí)，加用補(bǔ)腎中藥療效更佳，特別在緩解疼痛、改善關(guān)節(jié)活動度和關(guān)節(jié)功能方面有一定的優(yōu)勢。 2.3