辛伐他汀抑制酒精誘導(dǎo)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞成脂及促進(jìn)成骨的實驗研究.pdf

1、研究目的： 酒精性股骨頭壞死(osteonecrosis 0fthe femoral head，ONFH)發(fā)病率高。目前，酒精性O(shè)NFH早期病例采取保守治療，晚期病例行人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)。但是，保守的療法效果差，許多患者只能是減輕關(guān)節(jié)疼痛，推遲行人工關(guān)節(jié)置換的年齡，而無有效的方法治愈早期病例，從而避免行人工關(guān)節(jié)置換。手術(shù)療法有很多并發(fā)癥，而且目前的人工關(guān)節(jié)壽命在15-20年，對于年輕患者在一生中常不可避免地要進(jìn)行人工關(guān)節(jié)翻修，第二

2、次行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)，帶來很多痛苦和不便，因此尋找一種能夠有效治療酒精性O(shè)NFH的保守療法是眾多學(xué)者研究的方向。以前的研究表明酒精可誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(marrow stromal cells，MSCs)成脂分化而抑制成骨分化，是酒精性O(shè)NFH的重要發(fā)病機(jī)制，而且針對此發(fā)病機(jī)制的保守療法研究取得了一定的成果。因此，本研究擬采用體外原代培養(yǎng)MSCs技術(shù)，建立酒精誘導(dǎo)MSCs成脂分化的細(xì)胞模型，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)及分子生物學(xué)等方面，觀察辛伐

3、他汀(simvastatin)抑制酒精誘導(dǎo)的MSCs成脂作用和辛伐他汀促進(jìn)MSCs成骨分化的作用，以探討辛伐他汀治療酒精性股骨頭缺血性壞死的可能。 方法： SD大白鼠(雄性，6周齡，由河南省實驗動物中心提供)，獲取貼壁生長的MSCs。待原代細(xì)胞長至融合后傳代，細(xì)胞以1×10<'4>個/ml接種，繼續(xù)培養(yǎng)。逐日用倒置顯微鏡觀察MSCs的形態(tài)及生長情況。以第二代細(xì)胞于接種R分組，并將接種日作為實驗觀察的0日。實驗樣本采用隨機(jī)

4、法分為3組：對照組(N)、模型組(M)和實驗組(S)。對照組以不加酒精及辛伐他汀的培養(yǎng)液培養(yǎng)，模型組在實驗周期的前半程以含濃度為0.09mol/L酒精的培養(yǎng)液培養(yǎng)，后半程停加酒精；實驗組在實驗周期的前半程以含濃度0.09mol/L酒精的培養(yǎng)液培養(yǎng)，后半程停加酒精，改以含濃度1×10<'-7>mol/L辛伐他汀的培養(yǎng)液培養(yǎng)。逐日用倒置相差顯微鏡觀察MSCs的形態(tài)及生長情況。觀察內(nèi)容：以第二代細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)的第14天以相關(guān)試劑

5、盒檢測細(xì)胞24h骨鈣素(osteocalcin，OC)分泌量、細(xì)胞的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性；培養(yǎng)的第21天對細(xì)胞蘇丹Ⅲ染色，進(jìn)行脂肪細(xì)胞計數(shù)，以相關(guān)試劑盒檢測細(xì)胞的甘油三酯(triglyeride，TG)含量；以第二代細(xì)胞接種于100ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)的第14天以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain ReactionRT-PCR)

6、技術(shù)檢測成脂基因過氧化物酶體增殖子活化受體-γ(peroxisomeproliferator-activated receptor-γ，PPAγ)，成骨基因OC、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bonemorphogenetic protein-2，BMP-2)和核心結(jié)合因子al(core binding factor-al，Cbfal)的基因表達(dá)水平。統(tǒng)計學(xué)處理：實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示，實驗數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分

7、析，多組間比較采用單因素方差分析，樣本均數(shù)間的兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)a=0.05。 結(jié)果 1.脂肪細(xì)胞數(shù)：實施處理因素后第21天，與對照組比較，模型組中脂肪細(xì)胞數(shù)較多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，實驗組的脂肪細(xì)胞數(shù)稍多，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，實驗組和對照組脂肪細(xì)胞數(shù)均少于模型組脂肪細(xì)胞數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 2.細(xì)胞內(nèi)TG含量：實施處理因素后第21天，

8、與對照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，實驗組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量稍高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，實驗組和對照組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量均低于模型組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 3.細(xì)胞分泌的OC量：實施處理因素后第14天，與對照組比較，模型組細(xì)胞分泌的OC量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，實驗組細(xì)胞分泌的OC量稍低，差異

9、無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，實驗組和對照組細(xì)胞分泌的OC含量均高于模型組細(xì)胞分泌的OC量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05). 4.細(xì)胞ALP活性：實施處理因素后第14天，與對照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)ALP活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，實驗組細(xì)胞內(nèi)ALP活性稍低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，實驗組和對照組細(xì)胞內(nèi)ALP活性均高于模型組細(xì)胞內(nèi)ALP活性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

10、5.PPAR γ mRNA的表達(dá)：實施處理因素后第14天，與對照組比較，模型組細(xì)胞PPARymRNA表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，實驗組細(xì)胞PPARγmRNA表達(dá)水平稍高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；實驗組和對照組細(xì)胞PPAγmRNA表達(dá)水平均低于模型組細(xì)胞PPAγmRNA表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 6.OC mRNA的表達(dá)：實施處理因素后第14天，與對照組比較，模型組

11、OCmRNA表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，實驗組OC mRNA表達(dá)水平稍低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；實驗組和對照組細(xì)胞OC mRNA表達(dá)水平均高于模型組細(xì)胞OC mRNA表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 7.BMP-2 mRNA的表達(dá)：實施處理因素后第14天，與對照組比較，模型組BMP.2 mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，實驗組B

12、MP-2 mRNA表達(dá)水平稍低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；實驗組和對照組細(xì)胞BMP-2 mRNA表達(dá)水平均高于模型組細(xì)胞BMP-2 mRNA表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 8.Cbfal m：RNA的表達(dá)：實施處理因素后第14天，與對照組比較，模型組Cbfal mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，實驗組Cbfa 1 m.RNA表達(dá)水平稍低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05