乙型肝炎新型植物口服疫苗的研究.pdf

1、乙型肝炎(Hepatitis B,HB)是一種由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染所引起的傳染性疾病,我國大約有10％的人群是乙肝病毒攜帶者.目前仍然缺乏有效的治療手段治療HB,因此,主要靠接種疫苗來進行預(yù)防HB.由于現(xiàn)在使用商業(yè)化HBV疫苗主要通過酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn),存在較高的生產(chǎn)成本,而且需要冷藏,因此對邊遠和經(jīng)濟不發(fā)達地區(qū)人群疫苗接種普及帶來困難.此外,大約有10％的接種人群對現(xiàn)在商業(yè)化HB疫苗不產(chǎn)生明顯

2、免疫反應(yīng).因此,探索研制新型價廉的HB疫苗成為疫苗研究關(guān)注的焦點.本研究在國內(nèi)外已有工作基礎(chǔ)上,對人新型HBV表面抗原融合基因SSl進行了改造,并將SSl基因轉(zhuǎn)入植物中,開展了相關(guān)研究,取得以下主要結(jié)果. 1、為了分析新型乙肝表面抗原SSl(在乙肝主要表面抗原(S)的C端融合了乙肝表面抗原前體肽preSl(21-47aa))是否具有preSl的免疫原性,并在體內(nèi)激起針對preSl的抗體反應(yīng),我們依照大腸桿菌B株系的密碼子偏愛特性

3、改造和合成了全長的adr血清型preSl基因(spreSl)并在大腸桿菌進行了表達.結(jié)果顯示表達產(chǎn)物以可溶性形式存在,表達量占到總蛋白的44％,經(jīng)過Ni-NTA親和層析純化,純化的蛋白純度達到98％以上,western blot和間接ELISA結(jié)果表明該重組蛋白具有preSl的抗原性,而且抗原性與現(xiàn)在商業(yè)化的preSl相當.這些克服了以往在表達全長preSl蛋白時遇到的包涵體、表達產(chǎn)物不穩(wěn)定或低表達的難題. 2、為了探索生產(chǎn)一種

4、新型的HB口服疫苗形式,我們選擇了水稻作為新型乙肝表面抗原SSl的表達宿主.我們通過目前的文獻報道選取了水稻種子表達的高效表達啟動子PGluB4,構(gòu)建乙型肝炎抗原基因SSl的水稻種子高效表達載體p1300GSSI,通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化,實現(xiàn)了其在水稻種子中的表達.重組蛋白的表達量為31.5 ng/g DW種子,且能夠自組裝成病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)(virus-like particles.VLP),顆粒的粒徑大約為22±1:2 nm,沉降系數(shù)為1.2

5、5g.cm-3.Western blot結(jié)果顯示同時具有S和preSl抗原性.動物免疫試驗顯示重組蛋白能夠在小鼠體內(nèi)激起針對S和preSl的抗體反應(yīng),這些為今后的臨床評價提供理論基礎(chǔ). 3、為了進一步提高新型乙肝表面抗原SSl在植物體內(nèi)的表達水平,我們首次嘗試利用植物葉綠體表達系統(tǒng)進行這種新型乙肝表面抗原的表達.越來越多的研究表明植物葉綠體表達系統(tǒng)具有諸多優(yōu)越性,其中外源基因的高效表達最引人注目.乙肝表面抗原是一種糖蛋白,而且它

6、的糖基化程度與其抗原性直接相關(guān),本研究構(gòu)建了其煙草的葉綠體表達載體并進行了煙草的遺傳轉(zhuǎn)化,結(jié)果顯示外源基因被正確地整合到葉綠體基因組中預(yù)定的位點,表達的重組蛋白經(jīng)乙肝表面抗原檢測試劑盒檢測具有抗原性,相關(guān)的研究還在繼續(xù)中. 4、為了提高口服疫苗的免疫效果,我們對目前常用的免疫佐劑分子霍亂毒素B亞基蛋白(cholera toxin B,CTB)進行了大腸桿菌表達.本研究首先克隆了去除信號肽編碼序列的霍亂毒素B亞基基因CTB,構(gòu)建了