華支睪吸蟲病診斷抗原的篩選及ELISA診斷試劑盒的研制.pdf

1、華支睪吸蟲病(clonorchiasis)又稱肝吸蟲病，是我國常見的食源性寄生蟲病，流行于25個(gè)省市、自治區(qū)，以廣東省流行最為嚴(yán)重。全國現(xiàn)有肝吸蟲感染者1249萬，其中廣東省占500多萬。廣東省有81個(gè)縣市流行肝吸蟲病，珠江三角洲地區(qū)流行最為嚴(yán)重，個(gè)別地區(qū)人群感染率高達(dá)85﹪。華支睪吸蟲成蟲可長期寄生于人的肝膽管內(nèi)，對肝膽系統(tǒng)造成慢性損傷，引起膽管局限性擴(kuò)張、膽管炎、膽管上皮細(xì)胞腺瘤樣增生、肝硬化甚至誘發(fā)肝膽管腫瘤，是廣東省重點(diǎn)防治的地

2、方病之一。作為我國最重要的食源性寄生蟲病，引起了國家的高度重視，被列為國家重點(diǎn)防治的目標(biāo)疾病之一。 華支睪吸蟲病的正確診斷是防治的關(guān)鍵。目前華支睪吸蟲病的診斷主要依靠病原學(xué)檢查和免疫學(xué)檢測。傳統(tǒng)的病原學(xué)方法是鏡檢糞便中的蟲卵，由于華支睪吸蟲排卵具有周期性且蟲卵很小，容易漏診，且操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適合大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。免疫學(xué)診斷方法具有高度的敏感性和特異性，是病原學(xué)診斷的重要補(bǔ)充，在臨床輔助診斷和流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)揮了越來越重要的

3、作用。 目前，常用的免疫學(xué)診斷方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(E L I S A)，間接血凝試驗(yàn)(I H A)，間接熒光抗體試驗(yàn)(I F A T)，免疫酶染色技術(shù)(I E S T)，皮內(nèi)試驗(yàn)(I D T)等。ELISA方法具有高度的敏感性和特異性，操作簡便，無需特殊儀器設(shè)備，血樣用量少，結(jié)果容易判斷，適合現(xiàn)場應(yīng)用，是目前流行病調(diào)查和臨床診斷中應(yīng)用最為廣泛的免疫診斷方法。目前用于華支睪吸蟲病診斷的ELISA檢測試劑盒是用成蟲粗抗原檢測血清

4、中總IgG，假陰性和假陽性率都比較高，且存在診斷抗原的來源困難和難以標(biāo)準(zhǔn)化的問題。因此，應(yīng)用成分明確的重組抗原替代粗抗原是免疫診斷試劑盒研制的必然趨勢，關(guān)于華支睪吸蟲免疫診斷抗原的篩選和評價(jià)是國內(nèi)外華支睪吸蟲病研究的重點(diǎn)，也是本實(shí)驗(yàn)室近年來華支睪吸蟲研究的主要目標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)室通過華支睪吸蟲成蟲的功能基因組學(xué)研究，鑒定和克隆表達(dá)了一批華支睪吸蟲的重組抗原。這些重組抗原的制備為研制華支睪吸蟲病的免疫診斷試劑盒奠定了良好的基礎(chǔ)。 研

5、究目的 本研究是對本實(shí)驗(yàn)室已表達(dá)但沒有進(jìn)行免疫診斷價(jià)值評價(jià)的6種華支睪吸蟲重組蛋白，通過間接ELISA方法檢測從華支睪吸蟲病流行區(qū)的感染血清、正常血清和非流行區(qū)的正常血清中的總IgG或IgG<,4>亞類(IgG<,4>一般屬于短程抗體，驅(qū)蟲后轉(zhuǎn)陰時(shí)間短，被認(rèn)為具有療效考核價(jià)值)，評價(jià)其敏感性、特異性，從中篩選出能檢測某種特異性抗體類型或亞類并具有理想的敏感性、特異性和分辨率的一種或多種抗原，研制一種操作簡便，肉眼可直接判斷結(jié)果的

6、適合現(xiàn)場使用的ELISA篩查試劑盒和療效考核試劑盒，為我國華支睪吸蟲病的流行病調(diào)查、防治效果的評價(jià)提供一種簡便、快捷、準(zhǔn)確的血清學(xué)方法。 研究方法 1 華支睪吸蟲成蟲6種重組抗原的表達(dá)、純化華支睪吸蟲成蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶1(GST1)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2(GST2)、翻譯控制腫瘤蛋白(TCTP)、乳酸脫氫酶(LDH)、表膜蛋白(TP)、3-磷酸甘油酸激酶(PGK)6種重組蛋白的重組載體由本室保存。分別將六種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿

7、菌BL21，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)，根據(jù)其攜帶的GST或His標(biāo)簽，采用相應(yīng)的親和層析方法獲得純化重組蛋白，含有GST標(biāo)簽的重組蛋白用凝血酶切除GST，獲得純化的重組蛋白。 2 間接ELISA法評價(jià)六種候選抗原檢測特異性的總。IgG或IgG4亞類的敏感性和特異性 2．1 間接ELISA法檢測華支睪吸蟲病流行區(qū)人群血清中的特異性總IgG獲得純化的重組抗原后，以此作為包被抗原用間接ELISA法檢測血清中特異性的IgG。以GS

8、T2為代表，采用方陣法滴定抗原最佳包被濃度、血清最佳稀釋度、酶標(biāo)二抗最佳稀釋倍數(shù)。對6種抗原檢測病人血清中的總的IgG進(jìn)行初步篩選，篩選出一種或幾種特異性和敏感性都比較好的抗原。 2．2 間接ELISA法檢測華支睪吸蟲病流行區(qū)人群血清中的IgG<,4>亞類在2．1 篩選的基礎(chǔ)上，檢測病人和正常人血清中的IgG<,4>，評價(jià)其敏感性、特異性，從而找出最佳的診斷抗原和最佳的酶標(biāo)二抗。 2．3 間接ELISA診斷方法的建立及試

9、劑盒的生產(chǎn)工藝標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)化操作流程的制定用篩選出來的重組蛋白作為診斷抗原包被ELISA反應(yīng)板，試驗(yàn)確定最適抗原包被濃度、最適封閉液、最適血清稀釋度及工作時(shí)間、最適酶標(biāo)抗體稀釋度及作用時(shí)間、最適底物顯色時(shí)間和間接ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)，建立檢測華支睪吸蟲病人血清抗體的間接ELISA診斷方法。通過特異性試驗(yàn)、敏感性試、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和現(xiàn)場試驗(yàn)確定試劑盒的生產(chǎn)的工藝標(biāo)準(zhǔn)和操作標(biāo)準(zhǔn)。完成標(biāo)準(zhǔn)化的免疫診斷試劑盒的研制。 研究結(jié)果

10、 1 六種候選抗原的表達(dá)純化按照本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)確定的6種重組表達(dá)抗原的表達(dá)條件，6種重組質(zhì)粒在IPTG誘導(dǎo)下成功表達(dá)出重組融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE顯示與理論預(yù)測的融合蛋白分子量相符。其中CsTP和血吸蟲GST的融合蛋白進(jìn)行親和層析純化和酶切，獲得的純化CsTP蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定分子量與理論預(yù)測值相符。 2 6種重組抗原初步建立間接ELISA法，檢測華支睪吸蟲病流行區(qū)人群血清中總IgG以GST2為代表，建立間接ELIS

11、A方法，確定其最佳的反應(yīng)條件，其他5種蛋白初步按照GST2確定的條件，對6種蛋白的診斷價(jià)值進(jìn)行初步評價(jià)。篩選出比較理想的診斷抗原是GST2。 3 GST2作為診斷抗原檢測不同人群血清中的IgG<,4>亞類用重組抗原GST2檢測血清中特異的IgG<,4>，確定最佳的反應(yīng)條件，檢測華支睪吸蟲病流行區(qū)和非流行區(qū)感染血清和正常血清特異性IgG<,4>。血清做1：5稀釋后，流行區(qū)人群陰性血清的平均OD值為0.038，陽性血清的平均OD值為

12、0.602，陰性和陽性檢測結(jié)果差異非常顯著，肉眼觀察可以準(zhǔn)確判斷結(jié)果。其敏感性可達(dá)87.1﹪，特異性在95﹪以上，并與其他腸道寄生蟲感染血清進(jìn)行交叉反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其與蛔蟲、鉤蟲、鞭蟲、肺吸蟲、囊蟲血清、裂頭蚴、弓形蟲等均有不同程度的交叉，尤其與肺吸蟲交叉反應(yīng)率高達(dá)75﹪。 4 間接ELISA試劑盒最佳反應(yīng)條件的確定用方陣滴定GST2的最佳包被濃度為10 μ g/ml，血清最佳稀釋度為1：5及最佳反應(yīng)條件為37℃1h；最佳封閉條件為5

13、﹪脫脂奶粉37℃2h；酶標(biāo)二抗最佳稀釋度及最佳反應(yīng)條件為1：1，000，37℃1h；顯色液室溫顯色5min左右，2mol/LH<,2>SO<,4>50 μ 1終止反應(yīng)?；就瓿闪巳A支睪吸蟲病ELISA診斷試劑盒的生產(chǎn)工藝研究和實(shí)驗(yàn)室評價(jià)。 研究結(jié)論 1 成功表達(dá)出六種重組融合蛋白，并獲得足量的純化重組蛋白。 2 六種重組蛋白檢測病人血清中的總IgG，GST2效果最好，但敏感性和特異性仍不甚理想。 3 GS

14、T2作為診斷抗原，檢測特異性IgG<,4>，陰性結(jié)果和陽性結(jié)果差異顯著，敏感性達(dá)87.1﹪，特異性達(dá)95﹪以上。 4 確定間接ELISA試劑盒的最佳反應(yīng)條件為：抗原最佳包被濃度為10 μ g/ml；血清最佳稀釋度及最佳反應(yīng)條件為為1：5，37℃1 h；最佳封閉條件為5﹪脫脂奶粉37℃2h；酶標(biāo)二抗最佳稀釋度及最佳反應(yīng)條件為1：1，000，37℃1 h；顯色液室溫顯色5min左右終止反應(yīng)，讀數(shù)。基本完成了試劑盒的研制和實(shí)驗(yàn)室評價(jià)。