日本血吸蟲病無創(chuàng)型診斷試劑盒開發(fā)的前期研究.pdf

1、日本血吸蟲病是一種危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病，也是我國重點(diǎn)防治的重大疾病之一。血吸蟲病的主要危害在于血吸蟲蟲卵導(dǎo)致的肉芽腫及其組織的纖維化，患者在晚期可出現(xiàn)肝脾腫大、門脈高壓和腹水等嚴(yán)重的臨床癥狀，晚期患者會(huì)喪失勞動(dòng)力甚或死亡。因此，血吸蟲病及時(shí)診治具有重要的臨床意義。 血吸蟲病診斷常用方法主要有病原學(xué)和免疫學(xué)方法。由于病原學(xué)檢查費(fèi)時(shí)耗力，且漏檢率高，免疫學(xué)方法已成為目前現(xiàn)場查病的主要輔助診斷方法，且主要是以檢測(cè)血清中特異性抗體

2、的血清學(xué)方法，如ELISA、IHA等。但是在血吸蟲病疫區(qū)，反復(fù)的有創(chuàng)性采血，當(dāng)?shù)鼐用竦囊缽男栽絹碓讲?。而唾液作為診斷樣本因其采集簡單方便且無創(chuàng)越來越受到關(guān)注。已有研究結(jié)果提示研發(fā)以唾液作為檢測(cè)樣品的無創(chuàng)性診斷試劑盒是可行的。 目前用于血吸蟲病免疫診斷的抗原主要是血吸蟲粗抗原，但粗抗原制備困難，存在一定的交叉反應(yīng)，且不易標(biāo)準(zhǔn)化，導(dǎo)致檢測(cè)試劑批間質(zhì)量不穩(wěn)定。近年來，隨著基因重組技術(shù)以及生物信息學(xué)的日益發(fā)展，可對(duì)具有診斷價(jià)值抗原的組分

3、及性質(zhì)進(jìn)行分析鑒定，再通過重組表達(dá)純化，應(yīng)用于診斷。為此，我們利用感染者唾液中特異性的IgG作為探針，對(duì)已構(gòu)建的日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫進(jìn)行了免疫學(xué)篩選。應(yīng)用生物信息學(xué)分析技術(shù)，對(duì)陽性克隆的插入片段進(jìn)行序列分析，從中挑選具有診斷價(jià)值的抗原基因進(jìn)行克隆表達(dá)，并對(duì)其免疫學(xué)特性以及診斷價(jià)值進(jìn)行了初步驗(yàn)證，為進(jìn)一步研制無創(chuàng)性血吸蟲病診斷試劑盒提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 研究目的： 獲取能被日本血吸蟲感染者唾液中特異性抗體所識(shí)別的日本血吸蟲

4、抗原基因，并完成基因重組表達(dá)以及重組蛋白診斷價(jià)值評(píng)價(jià)，為研制能應(yīng)用于現(xiàn)場的無創(chuàng)型快速篩查診斷試劑盒奠定研發(fā)基礎(chǔ)。 研究內(nèi)容和方法： 1.日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫的免疫學(xué)篩選及其陽性噬菌體插入cDNA片段的序列分析 1.1利用日本血吸蟲病人唾液篩選日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫，獲得陽性噬菌體，并經(jīng)兩次復(fù)篩，選出強(qiáng)陽性克隆作為候選克隆。 1.2采用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增出候選噬菌體的插入片段，運(yùn)用直接

5、測(cè)序技術(shù)測(cè)定插入cDNA片段的核苷酸序列，經(jīng)編輯后的序列通過NCBI(the National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)的BLASTN，BLASTX軟件進(jìn)行分析。 2.候選基因的表達(dá)以及免疫學(xué)特性分析 2.1 PCR擴(kuò)增侯選基因開放讀碼框，克隆到載體pET32a(+)中，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、純化重組蛋

6、白后對(duì)重組蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。 2.2以血吸蟲感染者的血清和唾液以及非感染者的血清和唾液作為免疫探針，以重組蛋白作為抗原進(jìn)行Western blot。 2.3用純化的重組蛋白免疫小鼠，制備抗血清，以該血清作為探針，對(duì)重組蛋白和血吸蟲不同發(fā)育時(shí)期的可溶性蛋白進(jìn)行Western blot。 2.4設(shè)計(jì)侯選基因的特異性引物，提取日本血吸蟲蟲卵、尾蚴、成蟲的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)的cDNA，采用RT-PCR對(duì)候選編碼基因

7、在不同蟲期的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行分析。 3.間接ELISA反應(yīng)條件優(yōu)化及其診斷價(jià)值初步鑒定 3.1以純化融合蛋白為抗原，包被酶聯(lián)免疫反應(yīng)板，用間接ELISA法檢測(cè)日本血吸蟲感染者以及非感染者血清以及唾液。摸索最適抗原包被濃度、最適封閉液和封閉時(shí)間、最適血清反應(yīng)時(shí)間、濃度以及反應(yīng)溫度、最適二抗工作濃度、最適顯色時(shí)間條件。 3.2用已優(yōu)化的ELISA檢測(cè)體系以及AWAP作為包被抗原對(duì)日本血吸蟲感染者、非感染者的血清和唾液

8、進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)其敏感性和特異性。 研究結(jié)果： 1、日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫的免疫學(xué)篩選以及陽性噬菌體插入cDNA片段的序列分析 1.1日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫的免疫學(xué)篩選鑒定 以直徑為9cm平板含約近4×102個(gè)噬菌斑的密度進(jìn)行初篩，獲40多個(gè)初篩陽性噬菌體。初篩陽性噬菌體再復(fù)篩2次，最后挑取持續(xù)強(qiáng)陽性噬菌體21個(gè)。15個(gè)強(qiáng)陽性噬菌體擴(kuò)增出特異條帶，但其中8個(gè)擴(kuò)增片段大于500bp。取8個(gè)PCR產(chǎn)物送

9、去測(cè)序，經(jīng)Clustalw分析，去除重復(fù)序列后，最后得到7條待分析的cDNA序列。 1.2陽性噬菌體插入cDNA片段的序列分析 采用BIASTN和BLASTX與NCBI的GenBank中的已知DNA序列和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源性檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在待分析的7條cDNA序列中，與其它物種已知序列同源的序列有2條，未發(fā)現(xiàn)同源序列的有3條，與已知日本血吸蟲序列同源的序列有2條，其中一序列BLASTX分析結(jié)果顯示，所推導(dǎo)的氨基酸序列為

10、日本血吸蟲毛蚴相關(guān)蛋白，其理論分子量約為13kDa將該基因暫時(shí)命名為日本血吸蟲毛蚴相關(guān)蛋白(Miracidia associated protein of Schistosoma japonicum，SjMP13)基因。 2、SjMP13基因的表達(dá)以及免疫學(xué)特性分析 2.1編碼基因的擴(kuò)增、克隆和重組表達(dá) 根據(jù)GenBank中AY222893.1的序列信息，設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增SjMP13的ORF，進(jìn)而將獲得的目的基

11、因片段定向克隆到pET32a(+)質(zhì)粒中，經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序驗(yàn)證該目的基因克隆成功。將成功構(gòu)建的重組子pET32a(+)—SjMP13經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在較寬的溫度范圍和IPTG誘導(dǎo)濃度范圍內(nèi)都獲得了很好的表達(dá)；His親和層析柱純化的重組表達(dá)產(chǎn)物(rSjMP13)分子大小為35kDa經(jīng)質(zhì)譜鑒定，證明是SjMP13蛋白。 2.2 SjMP13轉(zhuǎn)錄水平分析 提取日本血吸蟲尾蚴、成蟲以及蟲卵的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合為cDNA，

12、采用RT—PCR對(duì)SjMP13編碼基因在不同蟲期的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SjMP13基因在不同發(fā)育期均有轉(zhuǎn)錄且轉(zhuǎn)錄水平相近。 2.3 rSjMP13抗原性以及免疫原性的分析 ①rSjMP13抗原性分析以制備的rSjMP13多抗血清為一抗進(jìn)行Western blot，結(jié)果顯示在日本血吸蟲蟲卵、尾蚴、成蟲粗提抗原均識(shí)別到一大小在55-72kDa之間的條帶，但其理論分子量約為13kDa。 ②rSjMP13

13、免疫原性分析純化后的重組蛋白能分別被日本血吸蟲感染者唾液和血清所識(shí)別，在35kDa左右處均可見一條明顯的免疫反應(yīng)帶，而陰性對(duì)照血清以及唾液在相應(yīng)的位置未識(shí)別出該蛋白條帶。 3、間接ELISA反應(yīng)條件優(yōu)化及其診斷價(jià)值初步鑒定結(jié)果 建立并優(yōu)化ELISA方法，最佳包被濃度為7.5μg/mL，最適封閉條件為5％脫脂牛奶37℃封閉1或1.5h；最適血清反應(yīng)條件為1:200稀釋37℃溫育90min；酶標(biāo)二抗1：25000稀釋37℃溫

14、育1h；以TMB顯色2min左右為佳。間接ELISA方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)血清以粗抗原為包被抗原檢測(cè)敏感性為95％，特異性為85.53％，符合率88.79％；以SjMP13為包被抗原檢測(cè)感染者以及非感染者的唾液敏感性為92.5％，特異性為92.11％，符合率為92.24％。 研究結(jié)論： 采用免疫學(xué)篩選及分子克隆技術(shù)，以唾液中特異性IgG為探針從日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫中分離到毛蚴相關(guān)蛋白基因(命名為，SjMP13)，并成功構(gòu)建了該