牛結(jié)核病多重組抗原間接ELISA試劑盒的研制及應(yīng)用.pdf

1、為了建立一種有效的牛結(jié)核病間接ELISA方法，本研究設(shè)計(jì)了3對(duì)引物，從牛分枝桿菌ValleeⅢ菌株的基因組中PCR擴(kuò)增出三個(gè)目的基因mpb70、mpb83和esat-6，采用重疊延伸剪接技術(shù)(splicebyoverlappingextension，SOE)獲得融合基因mpb70-mpb83。經(jīng)過(guò)多次亞克隆步驟后，將DNA片段mpb70-mpb83和esat-6串連于同一表達(dá)載體pET32a(+)中，獲得了重組質(zhì)粒pET70-83-E6

2、。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)帶有兩個(gè)六組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白rM70-83-E6。以Ni2+鰲合層析的方法純化該融合蛋白。Westernblot分析表明該蛋白具有良好的免疫反應(yīng)活性。 以融合蛋白rM70-83-E6作為包被抗原，在確定了最佳封閉液和最佳包被條件后，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法摸索了最佳抗原、一抗和二抗稀釋度，以及最佳一抗、二抗作用時(shí)間和顯色時(shí)間，建立了檢測(cè)牛結(jié)核病抗體的間接EL

3、ISA方法。用150份健康牛血清的檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析后確定診斷方法的判定標(biāo)準(zhǔn)，即樣本S/P大于0.5為陽(yáng)性，小于0.4為陰性，兩者之間為可疑。 通過(guò)對(duì)85份牛結(jié)核病血清和100份無(wú)結(jié)核病牛血清的檢測(cè)結(jié)果表明，ELISA方法的敏感性為69.41％(59/85)，特異性為96％(96/100)。對(duì)50份PPD陰性血清和67份PPD陽(yáng)性血清(117份)進(jìn)行檢測(cè)，并與PPD皮試進(jìn)行比較，本方法與PPD皮試診斷的符合率為82.05％。