Bim蛋白在慢性乙型肝炎患者PBMC凋亡中的作用.pdf

1、目的：慢性乙型肝炎是威脅人類健康的傳染病之一，主要是由乙肝病毒持續(xù)感染引起的。乙肝病毒是嗜肝病毒，主要通過免疫損傷引起肝細(xì)胞的破壞，如不及時清除將會引起肝臟反復(fù)的炎癥，最終導(dǎo)致肝硬化，甚至肝癌。
　　 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染人體后，機(jī)體的免疫反應(yīng)決定著疾病的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸。在慢性乙型肝炎(Chronic viral hepatitisB，CHB)患者中，CD4+T細(xì)胞和病毒特異性的CD8

2、+T細(xì)胞(cytotoxic T1-ymphocyte，CTL)減少，造成免疫功能降低，導(dǎo)致乙型肝炎病毒持續(xù)的感染，但這些免疫細(xì)胞減少的機(jī)制還不十分清楚。近年發(fā)現(xiàn)，外周血淋巴細(xì)胞在被病毒、細(xì)菌感染或有絲分裂原等刺激發(fā)生增殖活化反應(yīng)后是通過凋亡機(jī)制來清除的，這種現(xiàn)象被稱為激活后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(activation induced cell death，AICD)。目前研究發(fā)現(xiàn)CHB患者的外周血淋巴細(xì)胞(peripheral blood ly

3、mphocyte，PBL)經(jīng)抗原刺激活化后發(fā)生AICD的比率比正常對照組高，提示HBV可能通過誘導(dǎo)PBL凋亡增多，造成免疫細(xì)胞減少而使其感染得以持續(xù)，所以由HBV所致的T細(xì)胞活化后誘導(dǎo)凋亡過多可能是乙肝慢性化重要的機(jī)制之一。許多研究已經(jīng)證實在慢性乙型肝炎患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)表面死亡受體FasL和TRAIL較正常人是增加的，這可能是導(dǎo)致T細(xì)胞凋亡過多的原因之

4、一。
　　 線粒體途徑是T細(xì)胞凋亡的另一種途徑，主要通過Bcl-2家族的蛋白來調(diào)節(jié)。Bim蛋白是Bcl-2家族成員之一，只具有一個BH3結(jié)構(gòu)域，可以通過拮抗Bcl-2等抗凋亡因子的作用或直接與Bax等相互作用來誘導(dǎo)凋亡，在維持中樞耐受和外周耐受中有很重要的作用。關(guān)于Bim蛋白是否參與了AICD過程，在國內(nèi)研究很少。目前有研究表明在慢性免疫反應(yīng)中，F(xiàn)as和Bim共同調(diào)節(jié)T細(xì)胞的凋亡。為此我們通過體外模擬AICD的過程進(jìn)一步探討AI

5、CD發(fā)生的機(jī)制，為慢性乙肝肝炎的治療提供理論依據(jù)。通過研究促凋亡蛋白Bim在慢性乙型肝炎患者外周血單個核細(xì)胞激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的表達(dá)，以及其與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，進(jìn)一步探討慢性乙型肝炎患者PBMC凋亡增多的機(jī)制。
　　 方法：
　　 1入選標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)：選取慢性乙型肝炎患者共30例，其中男性16例，女性14例，年齡在18歲-55歲，平均年齡30歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2005年中華醫(yī)學(xué)會制定的“慢性乙型肝炎防治指南”，乙型肝炎標(biāo)

6、志物HBsAg陽性、HBeAg或抗-HBe陽性和抗-HBc陽性。排除HAV、HCV、HDV、HEV和HIV感染，排除近3個月應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、干擾素等影響免疫功能藥物的患者，除外有近期急性感染患者。健康對照15例，男9例，女6例，年齡在18歲-50歲，平均年齡28歲，取自健康獻(xiàn)血員。
　　 2用RT-PCR定量檢測HBV-DNA的含量。
　　 3 PBMC提取和培養(yǎng)：無菌條件下抽取肝素抗凝血4mL，應(yīng)用密度梯度離心法分離P

7、BMC。分離成功的PBMC加入植物血凝素(Phytohemagglutinin，PHA)100μg/ml刺激培養(yǎng)16-18小時，棄去PHA，加入外源性IL-21000U/L進(jìn)行培養(yǎng)至少7天后，用抗CD3抗體500ug/ml重新刺激48小時。
　　 4細(xì)胞凋亡的檢測
　　 培養(yǎng)的細(xì)胞用70％乙醇固定，4℃離心去掉固定液，并用冷PBS洗2次，加入含有RaseA的PI染液約1000μL，室溫靜置30分鐘后上流式細(xì)胞儀檢測凋亡率

8、。
　　 5 Bim蛋白的檢測
　　 剩余細(xì)胞，提取蛋白后，-80℃保存，待收集夠標(biāo)本后集中行Westernblot檢測Bim蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1經(jīng)抗CD3抗體刺激48h后，慢性乙型肝炎患者外周血單個核細(xì)胞凋亡率（27.04％±6.91％）與健康對照組（19.87％±4.83％）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.592，P＜0.01）。HBVDNA陽性組的PBMC的凋亡率（30.08％±8

9、.25％）與HBVDNA陰性組（24.21％±5.38％）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義( t=2.745，P＜0.05)。
　　 2在慢性乙型肝炎患者促凋亡蛋白Bim表達(dá)（0.99±0.33）與健康對照組（0.57±0.20）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.588，P＜0.01）。HBVDNA陽性組的外周血PBMC的中Bim蛋白表達(dá)（1.16±0.33）與HBVDNA陰性組（0.82±0.21）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.262，P＜0

10、.01)。
　　 3 PBMC中Bim表達(dá)與凋亡率成正相關(guān)(r=0.750，P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1在慢性乙型肝炎患者中PBMC在AICD過程中的凋亡率較正常人高，這可能是造成慢性乙肝患者免疫耐受的一個重要的原因。
　　 2在慢性乙型肝炎患者PBMC在AICD的過程中，Bim蛋白的表達(dá)較正常人高，且與凋亡率呈正相關(guān)，說明Bim蛋白參與了AICD的過程，可能是引起凋亡率增高的機(jī)制之一。