TCRγδT細(xì)胞在慢性乙型肝炎免疫發(fā)病機(jī)理中的作用研究.pdf

1、目的：慢性乙型肝炎作為一種我國常見的慢性傳染病，嚴(yán)重地危害著國民的生命健康。機(jī)體的免疫功能在機(jī)體清除HBV的過程中發(fā)揮著重要的作用。目前TCRγδ<'+>T(γδT)細(xì)胞與慢性乙型肝炎的關(guān)系還研究甚少，因此本研究以慢性HBV感染者為研究對象，以健康者作對照，探討外周血或肝穿組織的γδT等細(xì)胞是否有差異，分析與其它免疫細(xì)胞及臨床指標(biāo)是否有相關(guān)性；同時(shí)觀察分離及刺激的γδT細(xì)胞在體外的免疫功能。為了解γδT細(xì)胞在慢性乙型肝炎免疫發(fā)病機(jī)理中的

2、作用提供一些實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。 方法： 1．外周血γδT細(xì)胞與機(jī)體的免疫或臨床狀態(tài)的相關(guān)性研究：用流式細(xì)胞分析法，檢測40例慢性無癥狀HBV攜帶者(AsC)，30例慢性乙型肝炎(CHB)輕度，50例慢性乙型肝炎(CHB)中度至重度，及24例健康獻(xiàn)血員的外周血中γδT/T、82T/γδT、CD45RO<'+>γδT/γδT、CD45RO<'+>δ2T/δ2T、CD45RO<'+>T/T、CD4<'+>/T、CD8<'+>/T

3、、NK/lym(淋巴細(xì)胞)的細(xì)胞比例。以SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析健康對照及慢性HBV感染者各組間細(xì)胞比例的差異是否有顯著性；分析慢性HBV感染者各樣本的γδT、δ2T、CD45RO<'+>γδT、CD45RO<'+>δ2T的細(xì)胞比例是否與免疫細(xì)胞CD45RO<'+>T、CD4<'+>、CD8<'+>、NK等的比例具相關(guān)性，及是否與HBV-DNA或肝功具相關(guān)性。 2．慢性HBV感染患者肝穿標(biāo)本γδT細(xì)胞的檢測與分析：用免疫組織

4、化學(xué)方法，檢測5例慢性HBV感染患者肝穿標(biāo)本冰凍切片的γδT細(xì)胞。計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野的γδT細(xì)胞數(shù)，用SPSS13.0軟件分析γδT細(xì)胞數(shù)與外周血的γδT、δ2T細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性。 3．外周血γδT細(xì)胞的分離、刺激與擴(kuò)增：外周血經(jīng)密度梯度離心，2h貼壁及流式細(xì)胞陰性分選方法，分離6例慢性HBV感染者、3例健康對照者外周血γδT細(xì)胞，分析γδT細(xì)胞的純度及活性。以0.2、0.5、1、2μg/mL anti-Vγδ與50 U/mL r

5、hIL-2分別刺激擴(kuò)增γδT細(xì)胞14天，觀察細(xì)胞的狀態(tài)及數(shù)量，確定刺激的最佳濃度與時(shí)間。 4．外周血來源的γδT細(xì)胞的免疫功能的體外研究： 4.1 建立LO2-mock、LO2-HBV細(xì)胞模型：EcoR Ⅰ酶切掉pEcob6質(zhì)粒內(nèi)的雙拷貝HBV-DNA片段，自身連接作mock對照質(zhì)粒。以陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，轉(zhuǎn)染人肝源性非癌細(xì)胞LO2，用G418篩選出高效表達(dá)HBV相關(guān)抗原的抗性細(xì)胞克隆。用免疫熒光法、ELISA、AXS

6、YM(Abbott)、FQ-PCR等方法檢測LO2、LO2-mock、LO2-HBV細(xì)胞內(nèi)或上清中HBsAg、HBcAg/HBeAg、HBV-DNA的含量；用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞MICA/B的表達(dá)。 4.2γδT細(xì)胞的免疫功能的體外研究：用ELISA法檢測經(jīng)刺激擴(kuò)增后的γδT細(xì)胞上清的TNF-α、IFN-γ的分泌；用LDH釋放法檢測γδT細(xì)胞對LO2、LO2-mock、LO2-HBV的殺傷作用；比較分析6例慢性HBV感染者與3

7、例健康對照者γδT細(xì)胞的免疫功能的差異。 結(jié)果： 1．經(jīng)日檢驗(yàn)可知，γδT、CD45RO<'+>γδT細(xì)胞比例總體的差異無顯著性(P>0.05)，而δ2T(P<0.01)、CD45RO<'+>δ2T(P<0.05)比例的差異卻有顯著性。進(jìn)一步分割檢驗(yàn)，可得健康對照組的δ2T比例與其它組的差異均有顯著性(P<0.01)；CHB中重度組的δ2T比例與其它組的差異有顯著性(P<0.01)；健康對照組的CD45RO<'+>δ2T

8、比例與AsC組及CHB中重度組的差異有顯著性(P<0.05)。經(jīng)H檢驗(yàn)或F檢驗(yàn)可得，健康對照組與AsC組的CD45RO<'+>T(％)的差異有顯著性(P<0.05)；健康對照組與CHB輕度組的NK(％)的差異有顯著性(P<0.05)。 2．經(jīng)Spearman相關(guān)分析可得，δ2T與γδT細(xì)胞比例正相關(guān)(P<0.05)，與CD45RO<'+>γδT、CD45RO<'+>δ2T比例間呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)；γδT與CD4T比例負(fù)相關(guān)

9、(P<0.01)；CD45RO<'+>γδT、CD45RO<'+>δ2T、CD45RO<'+>T比例間高度正相關(guān)(P<0.01)。同時(shí)δ2T比例與ALT、AST、TB均呈顯著的負(fù)相關(guān)(P<0.01)；而CD45RO<'+>γδT、CD45RO<'+>δ2T與DB呈顯著的正相關(guān)(P<0.05)；HBV-DNA不與任一細(xì)胞比例相關(guān)(P>0.05)。 3．從所做的5例肝穿標(biāo)本看，γδT的計(jì)數(shù)均較低，平均每個(gè)高倍視野僅能見2-3個(gè)陽性細(xì)

10、胞。經(jīng)Spearman相關(guān)分析，肝穿組織γδT細(xì)胞計(jì)數(shù)與外周血γδT、δ2T細(xì)胞數(shù)間無相關(guān)性(P>0.05)。 4．經(jīng)流式陰性分選后，γδT細(xì)胞的純度從<23％提高到>71％，細(xì)胞活性大于90％；20ml外周血約可分到10<'6>左右的γδT細(xì)胞。在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)0.2μg/mL濃度的anti-γδ刺激γδT細(xì)胞9天較好。 5．經(jīng)LSCM可觀察到，LO2-HBV細(xì)胞內(nèi)HBsAg表達(dá)主要位于細(xì)胞漿內(nèi)而HBcAg可于胞核也可

11、位于胞漿內(nèi)，且HBsAg的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于HBcAg；LO2-HBV細(xì)胞上清的HBsAg/HBeAg為陽性，HBV-DNA為9.67×10<'4> copies/mL。而LO2及LO2-mock細(xì)胞均未檢測到HBV相關(guān)抗原的表達(dá)及HBV-DNA。LO2-HBV、LO2-mock、LO2細(xì)胞MICA/B的表達(dá)(MFI)分別為13.3±0.7、7.4±0.9、4.2±0.6，經(jīng)F檢驗(yàn)，差異具顯著性(P<0.01)。 6．經(jīng)ELISA

12、檢測，慢性HBV感染者的γδT細(xì)胞分泌IFN-γ及TNF-α分別為140.8±82.9pg/mL、129.8±71.5pg/mL，健康對照者的為440.7±172.8pg/mL、233.4±218.0pg/mL。經(jīng)t檢驗(yàn)得，兩組的IFN-γ的分泌的差異有顯著性(P<0.01)，而TNF-α無顯著性差異(P>0.05)。 7．經(jīng)LDH釋放法可檢測到，在效靶比為30:1下，慢性HBV感染組對靶細(xì)胞LO2、LO2-mock或LO2-H

13、BV的殺傷率為9.98±1.2％、11.05±3.5％、18.1±6.0％；而健康對照組的為16.6±1.04％、18.7±0.98％、31.5±4.16％。經(jīng)t檢驗(yàn)得，兩組對三種靶細(xì)胞的殺傷能力的差異均具顯著性(P<0.05)；同時(shí)LO2與LO2-HBV間，LO2-mock與LO2-HBV間殺傷率的差異有顯著性(P<0.05)。 結(jié)論： 1．慢性HBV感染不會引起外周血γδT細(xì)胞比例的顯著性改變，但可使δ2T亞型比例降

14、低；慢性HBV感染患者外周血的γδT仍以δ2T細(xì)胞亞群為主；CD45RO<'+>δ2T細(xì)胞亞群是CD45RO<'+>γδT細(xì)胞的主要組成成分。 2．慢性HBV感染患者γδT與CD4比例呈負(fù)相關(guān)，與特異性CD8T或非特異性NK細(xì)胞不成顯著相關(guān)，提示γδT可能與輔助型T細(xì)胞免疫反應(yīng)相關(guān)；慢性乙型肝炎的肝細(xì)胞高免疫炎癥狀態(tài)(ALT/AST升高)伴隨著外周血δ2T細(xì)胞的減少；但HBV-DNA的載量不影響γδT細(xì)胞比例。 3．本實(shí)

15、驗(yàn)采用流式陰性分選的方法來分離外周血γδT細(xì)胞從細(xì)胞純度或活性上分析是基本可行的；獲得LO2-mock、LO2-HBV穩(wěn)定傳代細(xì)胞株，可用作本實(shí)驗(yàn)的靶細(xì)胞，也可用于分泌HBV-DNA的轉(zhuǎn)染細(xì)胞是否會影響γδT細(xì)胞的殺傷功能的實(shí)驗(yàn)研究。 4．經(jīng)刺激的慢性HBV感染者的γδT細(xì)胞IFN-γ分泌能力及殺傷LO2、LO2-mock與LO2-HBV的能力均弱于健康對照者，而TNF-α無顯著性差異。提示慢性HBV感染者的γδT細(xì)胞分泌IFN