2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、前言
   肌節(jié)同源盒基因同系物2(Muscle Segment Homeobox,Homolog of,2,Msx2)位于5號染色體長臂5q34-q35,編碼由263個氨基酸組成的蛋白質(zhì),它可以與核心轉(zhuǎn)錄復(fù)合物作用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。以往研究多集中在Msx2對顱骨、乳腺等組織發(fā)育的影響上,但最新研究發(fā)現(xiàn)Msx2基因表達(dá)異??捎绊懢铙w發(fā)育,導(dǎo)致小眼球畸形等多種先天性眼病。
   晶狀體作為眼屈光間質(zhì),具有屈光和調(diào)節(jié)的功能,實(shí)驗(yàn)證

2、明在小鼠圍產(chǎn)期移除晶狀體會導(dǎo)致眼前節(jié)多組織發(fā)育障礙,晶狀體功能不良也可直接導(dǎo)致視網(wǎng)膜等眼組織發(fā)育障礙,說明晶狀體的發(fā)育在眼組織發(fā)育過程中所起的作用至關(guān)重要。晶狀體形態(tài)發(fā)生可分三個階段,包括晶狀體的誘導(dǎo)和決定、晶狀體形態(tài)發(fā)生及晶狀體細(xì)胞分化。脊椎動物的晶狀體來源于頭部的表皮外胚層,最早的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)是形成晶狀體基板。晶狀體基板是與視泡相鄰的表皮外胚層增厚的區(qū)域,在視泡從前腦突出并與表皮外胚層緊密接觸之后才形成晶狀體基板。視泡與晶狀體基板之間

3、的相互作用很強(qiáng),并有細(xì)胞質(zhì)外延介導(dǎo)。在胚胎發(fā)育第10天,晶狀體基板和視泡的外層內(nèi)陷,形成晶狀體凹和視杯。胚胎發(fā)育第11天,晶狀體凹在表面外胚層閉合形成晶狀體泡。在這個時期,晶狀體凹面向視網(wǎng)膜一側(cè)的上皮細(xì)胞開始增厚,晶狀體泡后部的上皮細(xì)胞向前延伸分化成晶狀體纖維細(xì)胞。
   多年來國內(nèi)外學(xué)者對晶狀體發(fā)育過程以及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了大量研究。現(xiàn)階段對于晶狀體發(fā)育過程的調(diào)控,國內(nèi)外學(xué)者主要從信號傳導(dǎo)通路和轉(zhuǎn)錄調(diào)控兩方面進(jìn)行研究:1)信號傳

4、導(dǎo)通路:目前研究認(rèn)為晶狀體發(fā)育過程涉及BMP、FGF及Wnt等多種信號傳導(dǎo)通路,對晶狀體的發(fā)育起重要作用;2)轉(zhuǎn)錄調(diào)控:晶狀體調(diào)節(jié)基因(Pax6,Meis,Six3等)和結(jié)構(gòu)基因(Crystallins,MIP/aquaporin0等)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與晶狀體發(fā)育全過程直接相關(guān),在晶狀體發(fā)育過程中形成不同時期不同位置的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò),是晶狀體發(fā)育過程中最重要的調(diào)控途徑。任何晶狀體調(diào)節(jié)基因和結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控出現(xiàn)異常,都會導(dǎo)致晶狀體發(fā)育異常。

5、   最近研究發(fā)現(xiàn)Msx2表達(dá)異??梢杂绊懢铙w發(fā)育過程,導(dǎo)致晶狀體發(fā)育障礙。但Msx2作為新發(fā)現(xiàn)的眼部發(fā)育調(diào)控基因,其在眼部發(fā)育過程中的具體功能及作用機(jī)理尚不清楚。本研究利用Msx2基因敲除小鼠,通過觀察其晶狀體發(fā)育過程的變化,探討Msx2基因表達(dá)缺失對晶狀體早期發(fā)育的影響。
   材料和方法
   一、BrdU免疫組化分析:
   利用Msx2基因敲除小鼠、B6小鼠,BrdU標(biāo)記母鼠,制備胚胎發(fā)育10.5至

6、14.5天的石蠟切片,常規(guī)蘇木素.伊紅染色(HE染色)觀察Msx2基因敲除小鼠晶狀體發(fā)育形態(tài)的變化,免疫組織化學(xué)方法觀察Msx2基因敲除小鼠晶狀體內(nèi)BrdU標(biāo)記細(xì)胞的變化。
   二、原位分子雜交:
   觀察Msx2基因敲除小鼠晶狀體內(nèi)Pax6、Six3、Prox1、Mab21L1、Mab21L2、Sox2、PitX3、Mip、FoxE3的轉(zhuǎn)錄變化。以含有KNA聚合酶啟動子的cDNA質(zhì)粒為模板,利用RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄生成

7、RNA探針。取小鼠胚胎制取冰凍切片,原位分子雜交觀察Msx2基因敲除小鼠晶狀體內(nèi)Pax6、Six3、Prox1、Mab21L1、Mab21L2、Sox2、PitX3、Mip、FoxE3的轉(zhuǎn)錄變化。
   三、Real time RT-PCR定量分析FoxE3轉(zhuǎn)錄變化:
   將pEGFP-Msx2,pEGFP-C1利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至alpha-TN4鼠晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi),Trizol-Reagent提取細(xì)胞內(nèi)RNA,使用Su

8、per Script Ⅲ First-Strand Synthesis System for RT-PCR試劑盒,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA文庫。以不同的cDNA為模板,加入FoxE3正反引物及real-time PCR試劑盒內(nèi)的酶預(yù)混液及水,以beta-actin為組間對照進(jìn)行實(shí)時定量PCR。
   四、FOXE3啟動子分析:
   以小鼠基因組DNA為模板,PCR方法擴(kuò)增出不同長度的FoxE3啟動子片段,連接至pDRIVE

9、Vector上,提取目標(biāo)質(zhì)粒DNA。選擇DNA序列無突變及錯位的克隆質(zhì)粒,用DNA核酸內(nèi)切酶mluI,XhoI雙酶切,再利用T4DNA Ligase將啟動子片段克隆至真核表達(dá)載體pGL-3 Basic中,構(gòu)建不同長度含熒光素酶編碼序列及FoxE3啟動子的質(zhì)粒。利用脂質(zhì)體將含不同長度的FoxE3啟動子質(zhì)粒、pEGFP-Msx2、pDPIVE質(zhì)粒、空白載體及pCMV-Pax6、pCMV-sip1共同轉(zhuǎn)染至鼠晶狀體上皮細(xì)胞alpha-TN4細(xì)

10、胞內(nèi)。測定熒光素酶活性及LacZ報(bào)告基因的活性,記錄數(shù)值,對兩組數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
   結(jié)果
   從E10.5天開始,Msx2基因敲除小鼠的晶狀體發(fā)育過程與雜合子小鼠相比受到抑制,表現(xiàn)為晶狀體泡發(fā)育位置正常但體積變小,同時視網(wǎng)膜增厚。至E12.5天,Msx2基因敲除小鼠晶狀體上皮細(xì)胞分化不明顯,晶狀體明顯減小,并且晶狀體與角膜粘連,不分離。晶狀體與視網(wǎng)膜之間有神經(jīng)鞘細(xì)胞長入,將晶狀體向前推,晶狀體泡位置前移。在胚胎發(fā)

11、育第11.5天,Msx2基因敲除小鼠與對照組相比,BrdU標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)量明顯減少,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明兩種小鼠BrdU標(biāo)記細(xì)胞的比例有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
   原位分子雜交技術(shù)觀察到在胚胎E10.5天時,Msx2基因敲除小鼠的晶狀體中可觀察到FoxE3在晶狀體內(nèi)表達(dá)水平下降,至E12.5天,FoxE3的表達(dá)完全缺失,而Msx2雜合子小鼠中FoxE3在E10.5-12.5天的晶狀體前部上皮細(xì)胞中明顯表達(dá)。胚胎10.5至12.5天,同Msx2雜

12、合子小鼠相比,Msx2基因敲除小鼠晶狀體中Prox1的表達(dá)水平升高。胚胎10.5至12.5天,同Msx2雜合子小鼠相比,Msx2基因敲除小鼠視網(wǎng)膜中Sox2的表達(dá)缺失。而胚胎10.5天之后,Msx2雜合子小鼠及基因敲除小鼠中Sox2在晶狀體內(nèi)無表達(dá)。其他晶狀體發(fā)育過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Pax6、Mab21L1、Mab21L2、PitX3的表達(dá)在Msx2基因敲除小鼠及雜合子小鼠中無差異、Mip作為晶狀體發(fā)育的結(jié)構(gòu)蛋白,在兩種小鼠中的表達(dá)

13、無明顯差異。
   當(dāng)鼠晶狀體上皮細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染pEGFP-Msx2及空白對照的pEGFP-C1后,轉(zhuǎn)染Msx2的晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)FoxE3的表達(dá)在第23個擴(kuò)增周期時達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)水平,而空白對照組晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)FoxE3的RNA表達(dá)在第38個擴(kuò)增周期達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)水平,統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Msx2后,FoxE3的表達(dá)量提高了77.5倍。
   對Msx2及不同長度的FoxE3啟動子共同轉(zhuǎn)染鼠晶狀體上皮細(xì)胞后,熒光素酶活性及l(fā)acZ

14、報(bào)告基因活性測定,發(fā)現(xiàn)當(dāng)sip1、smad5結(jié)合物及Pax6共同結(jié)合于FoxE3啟動子,作用于FoxE3啟動子的啟動子及遠(yuǎn)端增強(qiáng)子序列,可以促進(jìn)FoxE3的轉(zhuǎn)錄。
   結(jié)論一、Msx2基因敲除小鼠晶狀體發(fā)育異常,表現(xiàn)為無晶狀體或小晶狀體,晶狀體與角膜組織分離遲緩。
   二、Msx2基因敲除后,影響了晶狀體細(xì)胞的細(xì)胞周期,抑制晶狀體上皮細(xì)胞離開細(xì)胞周期,進(jìn)行細(xì)胞分化。
   三、胚胎發(fā)育10.5-12.5天,M

15、sx2基因敲除小鼠晶狀體中FoxE3表達(dá)水平下降直至缺失。
   四、胚胎發(fā)育10.5-12.5天,Msx2基因敲除小鼠晶狀體中Prox1表達(dá)水平上調(diào)。
   五、胚胎發(fā)育10.5-12.5天,Msx2基因敲除小鼠視網(wǎng)膜中Sox2表達(dá)缺失。
   六、Msx2基因敲除后可通過抑制FoxE3基因的表達(dá),上調(diào)Prox1的表達(dá)來調(diào)控晶狀體發(fā)育,Msx2不僅參與晶狀體發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,而且在轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于上游位置,在晶

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