miRNA調控晶狀體上皮細胞凋亡的機制研究.pdf

1、目的：
　　為進一步探討年齡相關性白內障的發(fā)病機制，本研究采用miRNA芯片技術篩選人眼年齡相關性白內障晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞中miRNA的表達譜，并對hsa-miRNA-15a調控晶狀體上皮細胞凋亡機制進行熒光定量分析及細胞培養(yǎng)過表達檢測，進一步闡明年齡相關性白內障與晶狀體上皮細胞凋亡的關系，為白內障的基因治療奠定基礎。
　　方法：
　　1、miRNA芯片篩選miRNA在年齡相關性白內障晶狀體上皮細胞及正

2、常晶狀體上皮細胞中的表達譜，初步篩選出與年齡相關性白內障發(fā)生相關的miRNAs表達譜，為miRNAs參與晶狀體上皮細胞凋亡行為的機制提供研究基礎。
　　本研究采用miRNAs芯片技術，選取5例年齡相關性白內障晶狀體前囊膜及5例正常晶狀體前囊膜，檢測兩種晶狀體上皮細胞內miRNAs的表達，篩選出與白內障發(fā)生相關且差異大于2倍的miRNAs。
　　2、檢測hsa-miRNA-15a及其靶基因bcl-2、mcl-1在年齡相關性白內

3、障晶狀體上皮細胞及正常晶狀體上皮細胞中的表達，研究hsa-miRNA-15a及其靶基因bcl-2、mcl-1在年齡相關性白內障發(fā)生過程中的變化，進一步闡明其在白內障發(fā)病機制中的作用。
　　本研究選取60例年齡相關性白內障患者，包括皮質性白內障20例、核性白內障20例和后囊下型白內障20例（分別標記為A、B、C組），20例正常晶狀體前囊膜上皮細胞做為對照組，采用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）方法檢測hsa-miRN

4、A-15a-5p、hsa-miRNA-15a-3p在對照組和三種不同類型年齡相關性白內障晶狀體上皮細胞中的表達;同上述方法，將獲取的晶狀體前囊膜一半用于Real-time PCR，另一半用于Western blot檢測，分別采用這兩種方法檢測其靶基因bcl-2和mcl-1在對照組和三種不同類型年齡相關性白內障晶狀體上皮細胞中的表達，并進行統(tǒng)計學分析。
　　3、培養(yǎng)人品狀體上皮細胞，將hsa-miRNA-15a過表達于人晶狀體上皮細

5、胞，檢測hsa-miRNA-15a對晶狀體上皮細胞凋亡的影響，從而進一步明確其對細胞凋亡產(chǎn)生的作用。
　　選取人晶狀體上皮細胞進行培養(yǎng)，分別轉染hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p，采取Real-time PCR驗證其在培養(yǎng)人細胞中的表達量，電鏡觀察轉染細胞形態(tài)學改變，通過MTS、平板克隆細胞增殖試驗，Hoechst、TUNEL、AnnexinⅤ-FTTC/PI凋亡檢測及細胞劃痕實驗和Transwel

6、l侵襲遷移實驗檢測細胞功能學的改變。
　　結果：
　　1.通過對年齡相關性白內障晶狀體上皮細胞和正常晶狀體細胞樣品miRNAs芯片表達譜的結果分析，以上調或下調＞2倍為基準，通過篩選，其中有181個miRNAs上調，有114個miRNAs下調。在這些miRNAs中，有126個上調超過5倍;有51個下調超過5倍。
　　2.通過Real-time PCR檢測結果顯示:hsa-miRNA-15a-5p、hsa-miRNA-1

7、5a-3p、在正常晶狀體上皮細胞中有少量表達，而在皮質性、核性及后囊下型白內障晶狀體上皮細胞表達量明顯增高，在皮質性白內障晶狀體上皮細胞中表達水平可達正常晶狀體的5-8倍，在核型白內障中達到10倍以上，在后囊下型白內障中甚至可達20倍以上。統(tǒng)計學分析結果顯示，hsa-miRNA-15a-5p在皮質性白內障組、核性白內障組、后囊下型白內障組中平均相對表達量與對照組比較差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01）;hsa-miRNA-15a-3p

8、在皮質性白內障組、核性白內障組、后囊下型白內障組中平均相對表達量與對照組比較差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。Real-time PCR和Western-blot檢測結果均顯示:bcl-2和mcl-1在正常晶狀體上皮細胞中可見表達，而在皮質性、核性及后囊下型白內障晶狀體上皮細胞中表達量明顯下調。統(tǒng)計學分析顯示，bcl-2在皮質性白內障組、核性白內障組、后囊下型白內障組中平均相對表達量與對照組比較差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01

9、）;mcl-1在在皮質性白內障組、核性白內障組、后囊下型白內障組中平均相對表達量與對照組比較差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　3.采用經(jīng)典的Taqman探針方法，對轉染了hsa-miRNA-15a-5p、hsa-miRNA-15 a-3p的人晶狀體上皮細胞(Human Lens Epithelial，HLE-B3)進行了定量分析。結果顯示在HLE-B3細胞中未檢測到hsa-miRNA-15a-5p或hsa-miRNA-

10、15a-3p，可能極低甚至不表達這兩種miRNA;轉染了hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p的HLE-B3細胞中，這兩種miRNA表達均有顯著提高。細胞形態(tài)顯示轉染了這兩種miRNA的細胞，從24h就開始發(fā)生改變，細胞變大變圓，輪廓不清，交織的網(wǎng)狀結構減少。MTS結果顯示轉染了這兩種miRNA之后，其生長明顯受到抑制。hsa-miRNA-15a-3p對HLE-B3生長的最大抑制率達到57.13％，hsa-m

11、iRNA-15 a-5p對HLE-B3生長的最大抑制率達到44.60％。平板克隆結果顯示hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15 a-3p對HLE-B3細胞的克隆形成能力也有明顯的抑制作用，TUNEL凋亡檢測結果顯示:轉染了這兩種miRNA的HLE-B3細胞檢測到明顯的綠色熒光，說明這兩種miRNA誘發(fā)了HLE-B3細胞的凋亡。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測顯示轉染后的HLE-B3細胞，其細胞碎片明顯

12、多于對照組;劃痕實驗結果顯示轉染了hsa-miRNA-15a-5p的HLE-B3細胞的水平遷移能力受到明顯抑制，而轉染hsa-miRNA-15a-3p的細胞沒有影響。
　　結論：
　　1.年齡相關性白內障晶狀體上皮細胞中miRNAs表達譜與正常晶狀體上皮細胞表達譜有差異，差異表達的miRNAs可能參與了年齡相關性白內障的發(fā)生。
　　2 hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p在三種不同類型的年

13、齡相關性白內障晶狀體上皮細胞中表達均較正常晶狀體上皮細胞表達升高;而bcl-2和mcl-1均較正常晶狀體上皮細胞表達降低。hsa-miRNA-15 a-5p、hsa-miRNA-15a-3p可能通過抑制其靶基因bcl-2和mcl-1的表達促使細胞凋亡，導致年齡相關性白內障發(fā)生。
　　3.hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p轉染人晶狀體上皮細胞后抑制細胞增殖及克隆，促使晶狀體上皮細胞發(fā)生調亡，從而啟動了