RgpA基因疫苗防治種植體周圍炎的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景:
   種植體周圍炎是口腔內(nèi)應(yīng)用種植體修復(fù)的主要并發(fā)癥,主要表現(xiàn)為軟組織炎癥、牙齦出血、化膿和骨組織喪失。研究證明種植體周圍炎的發(fā)生與齦下菌斑的附著有重要關(guān)聯(lián),菌斑中主要是革蘭氏陰性厭氧菌,如牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線桿菌等[1]。在患有種植體周圍炎的種植體周齦溝內(nèi)會有大量的炎癥細(xì)胞,如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞,組織學(xué)觀察在種植體頸部有彈坑樣的骨喪失[2]。臨床上已有多種方法用來治療種植體周圍炎,包括手術(shù)方式、傳統(tǒng)抗菌

2、藥物應(yīng)用、超聲潔治和激光治療等[3-4]。這些治療各有自身的優(yōu)點,但這些方法的應(yīng)用因患者具體情況不同,效果也存在不確定性,不能成為徹底有效的方法[5-12]。
   Gonzalez等選用小鼠構(gòu)建牙周炎模型,驗證用牙齦卟啉單胞菌免疫動物能夠誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)以應(yīng)對牙周炎的發(fā)生發(fā)展[13-14]。但也有研究驗證用菌體免疫動物不如用專門的抗原序列效果好,抗原編碼序列構(gòu)建的質(zhì)粒免疫能夠誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫來對抗病原體,包括病毒、細(xì)菌和腫瘤

3、細(xì)胞等[15-17]。因此如果能利用此類方法對抗引起種植體周圍炎的病菌,將有助于防治由細(xì)菌感染引起的種植體炎癥的發(fā)生發(fā)展。
   牙齦卟啉單胞菌是牙周炎及種植體周圍炎的主要致病菌,包含有多種毒性因子,如牙齦素、牙齦素復(fù)合體(稱RgpA-Kgp復(fù)合體)、菌毛、脂多糖(LPS)、外膜泡、血凝素等。其中牙齦素是主要毒性因子,它包含有精氨酸特異性牙齦素R(Rgp)和賴氨酸特異性牙齦素K(Kgp)[18]。Rgp包含RgpA和RgpB兩種

4、,編碼基因分別為rgpA、rgpB,Kgp編碼基因為kgp。它們在牙周炎的致病過程中被驗證有重要的作用:侵襲宿主細(xì)胞、誘導(dǎo)組織破壞和骨吸收[19-20]。其中RgpA不僅影響細(xì)菌的定植和生長,而且侵襲和破壞宿主組織、影響免疫反應(yīng)和血管系統(tǒng)導(dǎo)致牙周炎具有臨床癥狀,同時它還具有很好的免疫原性,可誘導(dǎo)機(jī)體的保護(hù)性應(yīng)答,被認(rèn)為是很有潛力的疫苗抗原。應(yīng)用rgpA基因構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠能夠誘導(dǎo)大量的免疫性特異性抗體產(chǎn)生,這比用菌體免疫更加優(yōu)越

5、。但該類實驗在大型動物體內(nèi)尤其是種植體周圍炎的防治中并沒有相關(guān)研究。而本實驗的目的便是將基因疫苗在犬身上應(yīng)用,檢驗其在防治該類動物口腔內(nèi)種植體周圍炎發(fā)生發(fā)展中的作用。
   目的:
   構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-rgpA,并用重組質(zhì)粒免疫動物,驗證其在防治實驗性種植體周圍炎發(fā)生發(fā)展中的作用,為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
   方法:
   以牙齦卟啉單胞菌ATCC33277基因組為模板,設(shè)計引物擴(kuò)增rgp

6、A基因片段,并將其連接到pVAX1真核表達(dá)載體上。
   6只實驗犬被隨機(jī)分成A、B、C三組,拔除下頜雙側(cè)第二、三前磨牙后隨機(jī)植入螺紋圓柱型種植體,每只動物植入4枚。3個月后,骨結(jié)合良好,分組進(jìn)行免疫。A組動物給予重組質(zhì)粒pVAX1-rgpA,B組給予熱失活的牙齦卟啉單胞菌菌體,C組給予生理鹽水作為空白對照,每兩周重復(fù)免疫一次,共計3次。
   最后一次免疫后2周(此時記為基線期),將浸泡有牙齦卟啉單胞菌菌液的絲線結(jié)扎在

7、一側(cè)種植體頸部,每2周更換一次,共3次,綁線后0、2、4、6周時進(jìn)行種植體周探診深度(PPD)檢測,探診出血指數(shù)檢測(BOP),X線觀察。
   免疫開始前、免疫結(jié)束后2周收集血液和唾液樣本,檢測血清IgG和唾液分泌型IgA抗體。
   最后將動物給予過量麻藥處死,將種植體及其周圍軟硬組織制作厚約50um的硬組織切片,亞甲基蘭染色,鏡下觀察并測量垂直性和水平性骨喪失程度。
   結(jié)果:
   1、成功構(gòu)建

8、pVAX1-rgpA質(zhì)粒。
   2、動物免疫結(jié)束后結(jié)果顯示,A、B組動物IgG、IgA抗體較未免疫前明顯增高(P<0.05),且較C組顯示出更高的抗體水平(P<0.05)。A組較B組抗體反應(yīng)更明顯,但兩組之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
   3、三組動物探診深度在基線后4周開始出現(xiàn)具有統(tǒng)計學(xué)意義的差別,A、B組較C組PPD值小(P<0.05)。但在6周時檢查,差別并不顯著。探診出血指數(shù)(BOP)在各組間并沒有明

9、顯的統(tǒng)計學(xué)意義的差別(P>0.05)。
   4、組織切片觀察在種植體周骨喪失區(qū)有大量的炎癥細(xì)胞和細(xì)菌存在,尤其在螺紋結(jié)構(gòu)區(qū)域。A組綁線側(cè)種植體骨喪失不明顯,B、C組骨喪失比較嚴(yán)重。
   結(jié)論:
   1、rgpA基因構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒能有效誘導(dǎo)機(jī)體增強(qiáng)免疫反應(yīng),減弱種植體周軟組織炎癥,降低種植體周圍炎的骨喪失。
   2、用細(xì)菌菌體免疫雖然也有助于提高免疫抗體的分泌,卻不能有效阻止骨喪失的進(jìn)展,可以認(rèn)為

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