前交叉韌帶組織工程種子細(xì)胞的體外研究.pdf

1、前交叉韌帶是膝關(guān)節(jié)內(nèi)重要穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，損傷后缺乏自我愈合能力，通常需要利用移植物關(guān)節(jié)鏡下重建前交叉韌帶。各種移植物都有其局限性。利用組織工程方法構(gòu)建有望克服目前移植物的問題。種子細(xì)胞、生物材料和組織構(gòu)建是組織工程的三個(gè)基本要素。種子細(xì)胞的選擇成為韌帶組織工程的研究課題之一。本實(shí)驗(yàn)從研究ACL內(nèi)部組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)開始，比較四種成熟機(jī)體細(xì)胞（前交叉韌帶細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、跟腱細(xì)胞、內(nèi)側(cè)副韌帶細(xì)胞），從中篩選較為理想的種子細(xì)胞，最后體外誘導(dǎo)分化骨

2、髓基質(zhì)干細(xì)胞,探索誘導(dǎo)條件，為組織工程化ACL的種子細(xì)胞提供一種干細(xì)胞來源。 第一部分：前交叉韌帶組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)觀察 目的：了解前交叉韌帶近側(cè)、中段、遠(yuǎn)側(cè)區(qū)組織學(xué)特性，了解前交叉韌帶細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法及其生物學(xué)特性，為韌帶組織工程種子細(xì)胞的研究打下基礎(chǔ)。 方法：取兔ACL12條，進(jìn)行HE、甲苯胺藍(lán)、天狼猩紅染色，對(duì)近、中、遠(yuǎn)三段進(jìn)行比較。用組織塊法、酶消化法分離培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)不同代次細(xì)胞進(jìn)行相差顯微鏡觀察、生長(zhǎng)

3、曲線測(cè)定、Ⅰ型膠原免疫組化染色。 結(jié)果：HE染色見ACL中段細(xì)胞核呈特征明顯的短桿狀，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)區(qū)核呈圓形或卵圓形，細(xì)胞呈圓形，所有細(xì)胞均沿膠原束方向排列；甲苯胺藍(lán)染色中段呈陰性，近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)為陽性；天狼猩紅染色近側(cè)、中段、遠(yuǎn)側(cè)膠原Ⅰ、Ⅲ均為陽性。酶消化法分離培養(yǎng)貼壁快，細(xì)胞傳代五次后，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度、Ⅰ膠原分泌量明顯減低。 結(jié)論：兔前交叉韌帶近側(cè)區(qū)、中段、遠(yuǎn)側(cè)區(qū)在組織學(xué)上不同。酶消化法分離培養(yǎng)細(xì)胞更適合于組

4、織工程，前交叉韌帶細(xì)胞第一～第四代可作為構(gòu)建組織工程化前交叉韌帶的種子細(xì)胞，但取材困難，來源有限。 第二部分：前交叉韌帶組織工程種子細(xì)胞篩選的初步研究 目的：為組織工程方法構(gòu)建前交叉韌帶篩選較為理想的種子細(xì)胞。 方法：體外分離培養(yǎng)兔前交叉韌帶（ACL）、內(nèi)側(cè)副韌帶（MCL）、跟腱（AT）、皮膚成纖維細(xì)胞（SK），比較四種細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、增殖活性、Ⅰ、Ⅲ型膠原分泌量。 結(jié)果：在含體積分?jǐn)?shù)10％小牛血清的DM

5、EM培養(yǎng)液中，四種細(xì)胞生長(zhǎng)良好、細(xì)胞形態(tài)相似、但以SK細(xì)胞生長(zhǎng)最快，AT細(xì)胞次之，MCL細(xì)胞和ACL細(xì)胞生長(zhǎng)最慢。SK、MCL、ACL細(xì)胞均分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原，AT細(xì)胞只分泌Ⅰ型膠原。SK細(xì)胞Ⅰ型膠原染色密度較MCL、ACL 、AT細(xì)胞高，SK細(xì)胞Ⅲ型膠原染色密度較MCL、ACL細(xì)胞高。 結(jié)論：SK細(xì)胞增殖活性高，分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原多，取材簡(jiǎn)便，是較為理想的前交叉韌帶組織工程種子細(xì)胞。 第三部分：EGF在體外誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)

6、胞增殖分化為成纖維細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 目的：研究不同濃度表皮生長(zhǎng)因子在體外誘導(dǎo)兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成纖維細(xì)胞增殖分化的作用，為韌帶組織工程提供種子細(xì)胞來源。 方法：以2ng/ml、20ng/mlEGF 對(duì)體外培養(yǎng)的BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，進(jìn)行相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖，免疫組化半定量細(xì)胞分化。 結(jié)果：誘導(dǎo)后7d、14d時(shí)，2ng/ml、20ng/mlEGF 誘導(dǎo)組呈現(xiàn)更均一的纖維細(xì)胞樣帶有長(zhǎng)突起的

7、紡錘形細(xì)胞，呈束狀排列，比對(duì)照組具有更高的細(xì)胞密度；2ng/ml、20ng/mlEGF 誘導(dǎo)組在7、14d 細(xì)胞增殖均比對(duì)照組快；第10d 時(shí)，2ng/ml、20ng/mlEGF 誘導(dǎo)組、對(duì)照組膠原Ⅰ、Ⅲ染色均為陽性，但誘導(dǎo)組有更高的染色密度，誘導(dǎo)組之間無差別；2ng/ml、20ng/mlEGF 誘導(dǎo)組、對(duì)照組膠原Ⅱ染色陰性。 結(jié)論： EGF 有能力刺激細(xì)胞的增殖，并且能刺激符合肌腱和韌帶組織工程的細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)，但濃度2ng