受者或第三方淋巴細胞輸注預防及治療小鼠GVHD的研究.pdf

1、研究背景： 異基因造血干細胞移植可以治愈許多血液系統(tǒng)及非血液系統(tǒng)的嚴重疾病，移植的主要并發(fā)癥之一為急慢性移植物抗宿主病(GVHD)，是造成移植后非復發(fā)死亡的最常見原因之一。用具有免疫調(diào)節(jié)作用的細胞成份來調(diào)控GVHD是近幾年防治GVHD的一種新策略。目前研究較多的細胞成份有CD4+CD25+Tregs、間充質(zhì)干細胞、受者自身淋巴細胞等，在眾多具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠降低GVHD的細胞中，受者或第三方淋巴細胞具有采集方便、無需特殊分離

2、培養(yǎng)，易于臨床應(yīng)用等優(yōu)點。本課題選擇此類細胞作為對象，研究其在防治GVHD中的作用，以期為臨床提供一種控制GVHD的新方法。 第一部分：建立小鼠同種異體造血干細胞移植GVHD模型 [目的]：建立完全異基因造血干細胞移植及單倍型相合造血干細胞移植GVHD的動物模型，為探討受者或第三方淋巴細胞對同種異體造血干細胞移植GVHD的影響提供實驗平臺。 [方法]： 1.以近交系C57BL/6(H-2b)小鼠作為供者，

3、BALB/c(H-2d)作為受者，給予受者9.0Gy全身照射，進行骨髓細胞+脾細胞移植，建立完全異基因造血干細胞移植GVHD動物模型； 2.以C57BL/6(H-2b)作為供者，以(C57BL/6×BALB/c)F1(H-2b/d)(以下簡稱B6CF1)作為受者，給予受者9.0Gy全身照射，進行骨髓細胞+脾細胞移植，建立單倍型相合造血干細胞移植GVHD動物模型。 [結(jié)論]：本實驗成功地建立了完全異基因造血干細胞移植及單倍

4、型相合造血干細胞移植GVHD的動物模型，可利用此模型研究受者或第三方淋巴細胞對同種異體造血干細胞移植GVHD的影響。 第二部分：受者淋巴細胞輸注預防小鼠同種異體造血干細胞移植GVHD的研究 [目的]：探討受者淋巴細胞輸注對小鼠同種異體造血干細胞移植GVHD的發(fā)生是否起預防作用。 [方法]： 1.受者淋巴細胞輸注對全異基因造血干細胞移植GVHD的預防作用 以BALB/c(H-2d)作為完全異基因造血

5、干細胞移植的受鼠，給予9.0Gy全身照射后4h，隨機分為四組：①對照組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細胞懸液(4.5×106骨髓細胞+3.0×107脾細胞)，但不進行其他治療處理，觀察其造血恢復、植入及GVHD的發(fā)生情況；②1/6量受者淋巴細胞輸注組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細胞懸液(4.5×106骨髓細胞+3.0×107脾細胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射BALB/c小鼠脾細胞懸液(數(shù)量為5.0×106，相當于移植的C

6、57BL/6小鼠脾細胞量的1/6)，觀察其造血恢復、植入及GVHD的發(fā)生情況；③1/3量受者淋巴細胞輸注組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細胞懸液(4.5×106骨髓細胞+3.0×107脾細胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射BALB/c小鼠脾細胞懸液(數(shù)量為1.0×107，相當于移植的C57BL/6小鼠脾細胞量的1/3)，觀察其造血恢復、植入及GVHD的發(fā)生情況。④等量受者淋巴細胞輸注組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細胞懸液(4

7、.5×106骨髓細胞+3.0×107脾細胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射BALB/c小鼠脾細胞懸液(數(shù)量為3.0×107，相當于移植的C57BL/6小鼠脾細胞全量)，觀察其造血恢復、植入及GVHD的發(fā)生情況。 2.受者淋巴細胞輸注對單倍型相合造血干細胞移植GVHD的預防作用 以B6CF1(H-2b/d)作為單倍型相合造血干細胞移植的受鼠，給予9.0Gy全身照射后4h，隨機分為四組：①對照組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠

8、混合細胞懸液(4.5×106骨髓細胞+3.0×107脾細胞)，但不進行其他治療處理，觀察其造血恢復、植入及GVHD的發(fā)生情況；②1/3量受者淋巴細胞輸注組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細胞懸液(4.5×106骨髓細胞+3.0×107脾細胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射B6CF1小鼠脾細胞懸液(數(shù)量為1.0×107，相當于移植的C57BL/6小鼠脾細胞量的1/3)，觀察其造血恢復、植入及GVHD的發(fā)生情況；③等量受者淋巴細胞輸注組：

9、經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細胞懸液(4.5×106骨髓細胞+3.0×107脾細胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射B6CF1小鼠脾細胞懸液(數(shù)量為3.0×107，相當于移植的C57BL/6小鼠脾細胞的全量)，觀察其造血恢復、植入及GVHD的發(fā)生情況；④1.5倍量受者淋巴細胞輸注組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細胞懸液(4.5×106骨髓細胞+3.0×107脾細胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射B6CF1小鼠脾細胞懸液(數(shù)量為4.

10、5×107，相當于移植的C57BL/6小鼠脾細胞的1.5倍量)，觀察其造血恢復、植入及GVHD的發(fā)生情況。 [結(jié)論]：小鼠同種異體造血干細胞移植后輸注適當劑量的受者淋巴細胞，可以顯著降低造血干細胞移植后GVHD的發(fā)生率。 第三部分：第三方淋巴細胞輸注預防小鼠同種異體造血干細胞移植GVHD的研究 [目的]：探討第三方淋巴細胞輸注對小鼠同種異體造血干細胞移植GVHD的發(fā)生是否起預防作用。 [方法]：

11、1.父系淋巴細胞輸注對單倍型相合造血干細胞移植GVHD的預防作用 以子代B6CF1(H-2b/d)作為單倍型異基因造血干細胞移植的受鼠，給予9.0Gy全身照射后4h，隨機分為三組：①對照組：經(jīng)尾靜脈注射母系C57BL/6小鼠混合細胞懸液(4.5×106骨髓細胞+3.0×107脾細胞)，但不進行其他治療處理，觀察其造血恢復、植入及OVHD的發(fā)生情況；②1/6量父系淋巴細胞輸注組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細胞懸液(4.5×

12、106骨髓細胞+3.0×107脾細胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射父系BALB/c小鼠脾細胞懸液(數(shù)量為5.0×106，相當于移植的C57BL/6小鼠脾細胞量的1/6)，觀察其造血恢復、植入及GVHD的發(fā)生情況；③1/3量父系淋巴細胞輸注組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細胞懸液(4.5×106骨髓細胞+3.0×107脾細胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射父系BALB/c小鼠脾細胞懸液(數(shù)量為1.0×107，相當于移植的C57BL/6

13、小鼠脾細胞量的1/3)，觀察其造血恢復、植入及GVHD的發(fā)生情況。 2.子代淋巴細胞輸注對完全異基因造血干細胞移植GVHD的預防作用 以BALB/c(H-2d)作為完全異基因造血干細胞移植的受鼠，給予9.0Gy全身照射后4h，隨機分為四組：①對照組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細胞懸液(4.5×106骨髓細胞+3.0×107脾細胞)，但不進行其他治療處理，觀察其造血恢復、植入及GVHD的發(fā)生情況；②1/3量子代淋巴

14、細胞輸注組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細胞懸液(4.5×106骨髓細胞+3.0×107脾細胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射子代B6CF1小鼠脾細胞懸液(數(shù)量為1.0×107，相當于移植的C57BL/6小鼠脾細胞量的1/3)，觀察其造血恢復、植入及GVHD的發(fā)生情況；③等量子代淋巴細胞輸注組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細胞懸液(4.5×106骨髓細胞+3.0×107脾細胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射子代B6CF1小鼠脾細

15、胞懸液(數(shù)量為3.0×107，相當于移植的C57BL/6小鼠脾細胞的全量)，觀察其造血恢復、植入及GVHD的發(fā)生情況；④1.5倍量子代淋巴細胞輸注組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細胞懸液(4.5×106骨髓細胞+3.0×107脾細胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射子代B6CF1小鼠脾細胞懸液(數(shù)量為4.5×107，相當于移植的C57BL/6小鼠脾細胞的1.5倍量)，觀察其造血恢復、植入及GVHD的發(fā)生情況。 [結(jié)論]：小鼠同

16、種異體造血干細胞移植后輸注適量的第三方淋巴細胞(可以是親代或子代)，可以顯著降低造血干細胞移植后GVHD的發(fā)生率。 第四部分：受者淋巴細胞輸注治療小鼠完全異基因造血干細胞移植GVHD的研究 [目的]：探討受者淋巴細胞輸注對小鼠完全異基因造血干細胞移植GVHD的發(fā)生是否起治療作用。 [方法]： 1.以BALB/c(H-2d)作為完全異基因造血干細胞移植的受鼠，給予9.0Gy全身照射后4h，經(jīng)尾靜脈注射C57

17、BL/6小鼠混合細胞懸液(4.5×106骨髓細胞+3.0×107脾細胞)，但不進行其他治療處理，出現(xiàn)GVHD征象后，隨機分為三組； 2.對照組：不進行任何治療，觀察其造血恢復、植入及GVHD的轉(zhuǎn)歸情況； 3.單純受者淋巴細胞輸注組：出現(xiàn)GVHD征象后，經(jīng)尾靜脈注射BALB/c小鼠脾細胞懸液(數(shù)量為1.0×107，相當于移植的C57BL/6小鼠脾細胞量的1/3)，觀察其造血恢復、植入及GVHD的轉(zhuǎn)歸情況。 4.氟達