富血小板纖維蛋白對牙髓組織再生性影響的研究.pdf

1、牙髓是牙體組織內唯一的軟組織,承擔著不斷形成牙本質和向牙齒硬組織提供營養(yǎng)的重要功能。牙髓因受創(chuàng)或感染導致暴露時,其儲備的未分化間充質干細胞(mesenchymalstemcells,MSCs)遷移至損傷處增殖、分化為成牙本質樣細胞,并分泌牙本質基質形成修復性牙本質,這是牙髓自身修復的潛能,也是活髓保存治療的生物學基礎。然而傳統(tǒng)的活髓保存方法是利用生物活性分子促進損傷牙髓的修復,但生物活性分子在體內易被吸收,所需劑量大,限制了其在臨床中的

2、應用;此外,齲病、外傷等使牙髓組織因感染而去除后,采用根管治療的方法使牙齒變得易碎,從而降低了牙齒的功能和使用質量。因此,學者們探索采用牙髓干細胞(dentalpulpstemcells,DPSCs)作為種子細胞的組織工程方法來修復和重建牙髓組織,以便使患者獲得更好的生存質量。組織工程是模擬體內生長因子微環(huán)境,將細胞—生物材料—生長因子復合物植入機體組織、器官病損部位,形成具有特定形態(tài)和功能的相應組織、器官,而生物材料在形成新組織過程中

3、逐漸降解吸收。然而生物材料尚存在交叉感染及免疫排斥問題,而生長因子則存在輸送載體選擇、適宜劑量的確定、半衰期的影響及種屬來源免疫反應等問題,從而限制了組織工程在牙髓牙本質再生領域的臨床應用。
　　富血小板纖維蛋白(platelet-richfibrin,PRF)被認為是第二代富血小板濃縮物,其制備簡單、完全取自于自體血、不添加任何人工制劑等特點,從而避免了倫理道德的爭議及免疫排斥和血液交叉感染的風險;其富含多種生長因子,已有研究證

4、實其對多種MSCs的增殖、分化均具有促進作用,因此PRF的出現為牙髓牙本質的修復再生提供了可能性。但PRF復合牙髓干細胞植入去髓的牙髓腔后的修復機制還不清楚需要進一步系統(tǒng)的研究。本課題在體外分離、培養(yǎng)與鑒定犬牙髓干細胞的基礎上,擬通過體內、外研究來評估PRF在牙髓牙本質再生中可能發(fā)揮的生物學效應以及構建組織工程化牙髓牙本質結構的可行性,以期為組織工程化牙髓牙本質最終的臨床應用提供新的契機與研究基礎。
　　1.犬牙髓干細胞的分離、培

5、養(yǎng)與鑒定
　　犬麻醉后,從犬上頜第一磨牙中獲取牙髓,并通過酶消化法分離、培養(yǎng)犬DPSCs,并通過有限稀釋法克隆化傳代培養(yǎng)犬牙髓干細胞,檢測其克隆形成率;采用流式細胞儀鑒定干細胞表面標記物;通過MTT及成骨/成牙本質誘導、成脂誘導等檢測細胞的增殖與多向分化能力。
　　2.富血小板纖維蛋白的制備
　　將同一犬麻醉后,一次性注射器于犬頸部采集靜脈全血約10ml,紗布壓迫止血,隨即將血液轉入無菌玻璃離心管中,用盛有相同體積水的

6、離心管配平后,立即置于離心機以3000r∕min離心10min,靜置3~5min即可得到纖維蛋白凝塊,此時血液分3層,中間層即為PRF凝膠。將其中多余的液體擠出,即可獲得柔韌的纖維蛋白膜。將PRF縱向剪開使紅端均勻分部,將PRF分為1/8PRF、2/8PRF、3/8PRF組,在實驗第1d將PRF加入相應培養(yǎng)液中,與細胞共培養(yǎng)7d后去除,用于觀察不同濃度PRF對犬牙髓干細胞的生物學效應。
　　3.富血小板纖維蛋白對基于DPSCs的牙

7、髓牙本質再生效應的影響
　　將不同濃度的PRF加入正常培養(yǎng)液及成牙本質/骨成誘導液,研究PRF對DPSCs體外增殖及成牙本質/成骨能力的影響。結果表明:不同濃度PRF在7d連續(xù)培養(yǎng)期內均能明顯促進犬牙髓干細胞的增殖,該促進作用具有明顯時間依賴性而無PRF濃度依賴性。不同濃度PRF可通過上調成牙本質/成骨早期標記基因ALP、DSPP及晚期標記基因DMP1來促進犬牙髓干細胞成牙本質/成骨方向分化,該效應既具時間依賴性又具有PRF濃度依

8、賴性。
　　4.富血小板纖維蛋白對DPSCs的體內組織再生能力的影響
　　體內研究結果表明:將PRF復合犬牙髓干細胞膜片構建DPSCs/PRF雙膜復合體后植入裸鼠皮下,4w、8w取材后HE及Masson染色發(fā)現,DPSCs/PRF雙膜復合體較單純的DPSCs膜片組具有更強的形成牙髓牙本質樣組織的能力。犬取材標本HE染色結果顯示,DPSCs/PRF雙膜復合體植入組在8w時有較典型的類牙髓牙本質樣組織形成;Masson染色、DS

9、PP及BrdU標記細胞免疫組化發(fā)現髓腔內有明顯的血管、成牙本質樣細胞及牙本質樣基質形成,且植入的犬牙髓干細胞是新生組織的主要細胞基礎。
　　綜上所述,自體PRF與犬牙髓干細胞有良好的生物學相容性,不同濃度的PRF在犬DPSCs體內外增殖與分化中均有促進作用,利用PRF的這種特性,本課題組構建的新型DPSCs/PRF雙膜復合體移植物,將牙髓干細胞與自體PRF有機結合,可在異位及原位成功實現類牙髓牙本質再生修復。該研究所取得的進展有望